Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

Cromatografía Líquida Clásica

La cromatografía líquida considerada como clásica se lleva a cabo en columnas abiertas de vidrio, en ella la fase móvil fluye por gravedad o mediante la aplicación de vacío. La longitud de la columna debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su diámetro.

Métodos Cromatográficos

Hay cinco métodos cromatográficos:

• Cromatografía de Reparto:
  • Cromatografía en fase normal.
  • Cromatografía en fase reversa.
• Cromatografía iónica.
• Cromatografía de Exclusión.
• Cromatografía de adsorción.

La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas del relleno, si bien, en este caso, la fase móvil fluye con mayor dificultad. Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de tamaños muy pequeños (entre 3 y 10 μm), se requiere una instrumentación sofisticada.

Cromatografía de Reparto

Es la más utilizada, para compuestos polares, no iónicos, de baja a moderada masa molecular (<2000 Da).

Más recientemente se utiliza para compuestos iónicos derivatizados (formación de pares iónicos).

Líquido-líquido:

Fase estacionaria unida por adsorción física.

Desventaja: pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil.

Fase unida químicamente:

El soporte más común es la sílice. (Diámetro entre 3, 5 o 10 μm); porosidad (hasta 0.80 μ).

Rellenos tipo siloxano para fase inversa: Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo)

Mecanismos de retención de solutos (por disolución, equivalente a una fase líquida no polar, por adsorción física.

Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de siloxano en fase inversa.

pH < 7,5 para evitar hidrólisis del enlace siloxano.

Cromatografía en fase normal

Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre sílice o alúmina) y fase móvil apolar.

Solventes no polares (etiléter, cloroformo y n-hexano).

Rellenos tipo siloxano para fase normal:

• amino (C3H6NH2) (los más polares)
• diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia)
• dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia)
• ciano (C2H4CN) (los menos polares)

La competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante de los factores de retención.

Cromatografía de fase inversa

Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase móvil polar (agua, metanol, acetonitrilo).

Los cambios de solvatación del analito en el disolvente son determinantes por cambios de factores de retención.

Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad se controla fundamentalmente con la composición de la fase móvil.

Sílice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos días μmol/m² de grupos OH.

Inmovilización química (90% de rendimiento)

Si- OH + X- Si- (CH₂)_n– L                -Si- O-Si- (CH₂)_n-L

sílice            organoclorosilano             siloxano

n = 8 o 18

L: metil, amino, carboxil, ciano, diol

Recubrimiento máximo 4 μmol/m² de grupos.

Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano.

Actualmente, el 75% de los análisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un análisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua.

Criterios de selección

• Polaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos. (Evitar tiempos de retención muy altos).
• Fase móvil con polaridad distinta a la fase estacionaria.
• Polaridad creciente:
  • Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes
• k’ (factor de retención) entre 2 y 5.

Selectividad:

• En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k’.
• En fase normal se ajusta con etiléter, cloruro de metileno y cloroformo, n-hexano para ajustar k’.

Formación de derivados

1. Reducción de polaridad que haga posible el uso de cromatografía de reparto.
2. Aumento de respuesta del detector.
3. Aumento de selectividad de la respuesta.

Cromatografía de pares iónicos

Fase móvil: agua + disolvente orgánico (metano o acetonitrilo) + compuesto iónico con contraión de carga opuesta a la del analito.

El contraión forma un par iónico con el analito: especie neutra retenida por el relleno de fase inversa.

Cromatografía con fases estacionarias quirales

Más apropiada en HPLC que en CG.

Relleno recubierto con un isómero ópticamente activo.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

CONCEPTO

Abarca un conjunto de procedimientos cromatográficos en donde la fase móvil es impulsada a través de la columna utilizando la presión. Se puede clasificar en dos tipos:

• Cromatografía HPLC
• Cromatografía NHPLC (Nano cromatografía HPLC)

VENTAJAS

• Tamaño de partícula 3 a 10 µm
• Tiempos de separación más cortos
• Sensibilidad
• Fácil adaptación
• Gran aplicación

DESVENTAJAS

• Costo de los equipos
• Costo de los reactivos

VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA EFICACIA DE LA COLUMNA

A) EFECTO DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA DEL RELLENO

Influye en la disminución del orden 10 ó más veces de la altura del plato.

B) ENSANCHAMIENTO DE BANDA EXTRACOLUMNA

Se produce cuando el soluto es transportado a través de los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. Existe diferencia de velocidad entre los fluidos adyacentes a las paredes del tubo y las de la parte central.

C) EFECTO DEL TAMAÑO DE MUESTRA

Está relacionado con la cantidad de muestra sobre la fase estacionaria (µg de muestra / g de relleno) y el tipo de cromatografía.

INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA HPLC

Se utilizan los siguientes componentes:

• a) Recipientes para la fase móvil.
• b) Sistema de bombeo:
  • Bombas
  • Control de caudal
  • Sistema de programación
• c) Sistema de inyección de la muestra:
  • Jeringas (septum)
  • Bucles
• d) Columnas:
  • Pre – columnas
  • Columnas Analíticas
• e) Detectores
  • Basados en la medida de una propiedad de la disolución
  • Basados en la medida de una propiedad del soluto

a) RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL

Pueden ser 1 ó más de vidrio o acero inoxidable con capacidades desde 200 – 1000 ml. Están equipados con sistemas para eliminar gases disueltos (O₂ y N₂).

• Dentro de los desgasificadores tenemos: Bombeo al vacío, destilación, agitación o sistema de purga (se usan gases inertes). El más utilizado es la filtración al vacío.
• Cuando se usa un solo disolvente en forma constante se denomina elución isocrática.
• Elución en gradiente: Se varía la relación de los disolventes en función del tiempo o del volumen.

b) SISTEMA DE BOMBEO

Es un conjunto de partes que se encargan de suministrar y administrar la fase móvil a la columna. Debe cumplir los siguientes requisitos:

1. Generación de presiones por encima de 6000 psi.
2. Flujo libre de pulsaciones.
3. Intervalo de caudales de 0,1 a 10 ml.
4. Control y reproducibilidad del caudal.
5. Componentes resistentes a la corrosión.

Está formado por:

BOMBAS

Son las encargadas de impulsar la fase móvil a la columna, pueden ser de 3 tipos:

• Bombas recíprocas: Son las más utilizadas comercialmente, tienen las siguientes ventajas: pequeño volumen interno 35 – 400 µl, altas presiones de salida (mayores a 10000 psi), fácil adaptación al gradiente, caudales constantes. Su desventaja es presentar flujo pulsado.
• Bombas de Desplazamiento: Son grandes cámaras con una jeringa accionada por un motor de pasos.
  • Ventaja: Flujo libre de pulsaciones. Desventaja: Capacidad limitada (aprox. 250 ml) y difícil adaptación al cambio de solventes.
• Bombas Neumáticas: Generan la presión a una cámara plegable mediante gas comprimido. Ventajas: Son baratas, libre de pulsaciones; pero presentan numerosas desventajas como: limitada capacidad, presión de salida, el caudal depende de la viscosidad, no permiten utilizar gradiente y presentan presiones menores de 2000 psi.
• CONTROL DE CAUDAL: Utilizan restrictores que miden la caída de la presión, se encuentran ubicados a la salida de la bomba y van a regular la velocidad del motor de la bomba.
• SISTEMA DE PROGRAMACIÓN: Es el encargado de programar y variar los caudales de la fase móvil.

c) SISTEMA DE INYECCIÓN DE LA MUESTRA

Se utilizan volúmenes pequeños de muestra que van desde décimas de microlitros hasta los 500 µl. Existen dos formas de inyectar una muestra:

• Utilizando una jeringa a través de un septum de cierre hermético, para ello se usan microjeringas que resisten presiones hasta 1500 psi, su ventaja es la sencillez y su desventaja es la reproducibilidad.
• Existen bucles intercambiables desde 5 a 500 µl y resistentes a presiones de hasta 700 psi.

d) COLUMNAS

Es la parte principal del equipo, se clasifican en:

• PRECOLUMNAS: Se utilizan para proteger a la columna analítica, presentan mayor tamaño de partícula y sirven para eliminar los contaminantes y saturar a la fase móvil con fase estacionaria.
• COLUMNA ANALÍTICA: Tienen longitudes entre 10 y 30 cm. Son rectas y se pueden alargar acoplando más columnas, su diámetro interno es de 4 a 10 mm. Y el tamaño de partícula del relleno es de 5 a 10 µm; generan de 40000 a 60000 platos/metro.
• Existen columnas más pequeñas de 3 a 7,5 cm de largo, diámetro interno de 1 a 4,6 mm y tamaño de partícula 3 ó 5 µm. Tienen como ventaja rapidez y mínimo uso de F.M.
• En la actualidad la mayoría de equipos incluye hornos que controlan la temperatura desde 0 a 150 ºC.
• TIPO DE RELLENO DE LA COLUMNA
  • Se utilizan: Relleno pelicular, Partícula porosa.

e) DETECTORES

Las características de un detector ideal son:

1. Adecuada sensibilidad.
2. Buena estabilidad y reproducibilidad.
3. Tiempo de respuesta corto.
4. Manejo sencillo.
5. Respuesta similar para todos los solutos o selectiva.
6. No destructivo.

TIPO DE DETECTORES

• Basados en la medida de una propiedad de la disolución: Índice de refracción, constante dieléctrica ó densidad.
• Basados en la medida de una propiedad del soluto: Absorbancia U.V., Fluorescencia, etc.

CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFIA HPLC

1. Cromatografía de reparto:
   • a) Líquido – Líquido:
     • Fase normal
     • Fase reversa o inversa
   • b) De fase unida químicamente.
2. Cromatografía de adsorción.
3. Cromatografía iónica.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño.

Aplicaciones

Se aplica en las áreas de:

• Medicina/Biológicos: 33.9 %
• Farmacéutico: 18.7 %
• Agricultura/Alimentos: 8.2 %
• Química orgánica: 7.1 %
• Biotecnología: 6.4 %
• Medioambiente: 4.2 %
• Plásticos/Polímeros/caucho: 3.7 %
• Planes para el desarrollo de la instrumentación: 3.4 %
• Energía/Petróleo: 2.5 %
• Química inorgánica: 1.7 %
• Campo forense/Narcóticos: 0.8 %
• Otros: 9.4 %