- ELECTROFORESIS
CONCEPTO.-
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.- Fue empleado por primera vez en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte;
Aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular. - Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
- El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
- La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo
- Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.
- Clasificación de la Electroforesis
- Electroforesis libre o convencional
- Electroforesis en zona:
- Electroforesis en papel
- Electroforesis en gel
- Electroforesis Capilar o microelectroforesis
Electroforesis libre
- Es la forma más sencilla de realizar una electroforesis consiste en un tubo en forma de “U” donde se introduce un electrolito y la muestra además por supuesto, de los dos electrodos. Al conectar el sistema las macromoléculas comenzarán a migrar por el tubo hacia el polo opuesto y así irán diferenciándose según su carga. Uno de los inconvenientes que presenta esta técnica es la fluidez del medio, o sea, la facilidad con la que las partículas difunden, de modo que al cortar la corriente nos encontraríamos con la tendencia natural al equilibrio.
Electroforesis en Zona
- Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.
Soportes
Papel:
Tiene problemas debido sobre todo a la difusión, a la escasa resistencia a tratamientos bien de colorantes, bien enzimáticos necesarios en muchos experimentos.Acetatos de celulosa:
éstospresentaban los mismos inconvenientes, aunque eran más resistentes.- ·
Geles:
con menor difusión que en papel y más resistentes a los tratamientos. Geles de almidón
Su gran inconveniente es la imposibilidad de definir el tamaño de poro.Geles de acrilamida
- Permiten gran cantidad de tratamientos.
- Permiten regular el tamaño de poro.
- Muy estables y transparentes
- Permite separaciones más rápidas.
- Casi no presenta endósmosis.
ELECTROFORESIS CAPILAR
- La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener ventajas al respecto, Esta separaciones realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido.
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida recubierto con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line. Con esta técnica es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.
- Ventajas de la electroforesis capilar
Alta resolución (105a 106platos teóricos)-HPCE
Requiere pequeño volumen de muestra (1-10 nl)
Rápida separación (1 a 45 min.)
Aplicable a todo tipo de sustancias
Automatización
Cuantificación (lineal)
Reproducibilidad
Puede acoplarse a espectrometría de masa
Datos fundamentales
- Tipos de moléculas que pueden ser separadas por CE
Proteínas
Péptidos
Amino ácidos
Ácidos nucleicos
Ionesinorgánicos
Bases orgánicas
Ácidos orgánicos
- Aplicaciones
- Se aplica en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica con el fin de separar: Aniones y cationes inorgánicos, proteínas, aminoácidos, catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, ácidos nucleicos, enzimas, hormonas, anticuerpos, etc.