ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
1. INTRODUCCIÓN Y CONCEPTOS FUNDAMENTALES:
Las enzimas son proteínas que CATALIZAN reacciones químicas específicas en el ser vivo, es decir, son sustancias que no se consumen en la reacción pero aceleran las reacciones que, espontáneamente, se producen sin que sean necesarias condiciones extremas de presión, temperatura o pH.-.-.-.Se encuentran presentes en todos los tejidos, aunque no todos los tejidos tienen las mismas enzimas ni en igual cantidad.-.-.-.Por tanto, conociendo su función y su ubicación en los tejidos y en las células, podremos utilizarlas como marcadores de determinadas patologías.
1.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES:–
Son eficaces en muy pequeña cantidad.–No se alteran con la reacción.–Solo afectan a la velocidad con que se alcanza el equilibrio de la reacción.–Tienen mayor especificidad que los catalizadores químicos.
1.2 MODO DE ACCIÓN DE LOS ENZIMAS:
Cualquier reacción química se inicia con la ruptura de enlaces entre los átomos que forman las moléculas de los reactivos para formar, posteriormente , nuevos enlaces que originan las moléculas de los productos.—…–El ESTADO DE TRANSICIÓN o ACTIVADO se produce cuando los enlaces de los reactivos están debilitados o rotos pero todavía no se han formado los nuevos.–..–..En las reacciones químicas espontáneas se libera energía pero es necesario el aporte inicial de energía a las sustancias a reaccionar para que se produzca la reacción..–..–Esta energía se denomina ENERGÍA DE ACTIVACIÓN y cuanto menor sea ésta más fácilmente transcurre la reacción, acelerando la obtención de los productos..-.-.La función de los catalizadores consiste en disminuir esta energía de activación.———–Al inicio de la reacción se produce la interacción del enzima-sustrato a través de la unión del ¨centro activo del enzima -parte del enzima que sirve para unirse específicamente al sustrato- con el ¨sustrato mediante enlaces del tipo de puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals o, menos frecuentemente, covalentes.-.-.La unión de los radicales de los aminoácidos (enzima) al centro activo (sustrato) debilita los enlaces y provoca cambios energéticos que permiten conseguir más fácilmente el estado de transición. —–Existen dos hipótesis sobre el modelo de unión entre el centro activo del enzima y el sustrato: —Complementariedad (modelo llave-cerradura). El sustrato se une al centro activo del enzima por complementariedad de su estructura espacial. —Ajuste inducido (modelo cascanueces).El centro activo del enzima modifica su estructura inducido por el sustrato para que pueda producirse el acoplamiento.—–Cada enzima posee espacialmente una estructura específica de manera que le permite el reconocimiento de un solo sustrato, pero esta especificidad no es absoluta ya que existen enzimas con estructuras moleculares diferentes que pueden catalizar una misma reacción y reciben el nombre de ISOENZIMAS.-.-.-.Las PROENZIMAS son formas precursoras inactivadas de los enzimas. A este grupo pertenecen los enzimas proteolíticos, que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos.—-
1.3 COMPOSICIÓN:
Los ENZIMAS pueden realizar su función catalizadora: — por si mismas o — necesitar la presencia de otras fracciones no proteicas o cofactores.-.-.-.En estos casos la enzima se denomina HOLOENZIMA y está formada por: APOENZIMA – parte proteica – y el COFACTOR – parte no proteica de la enzima -.Nota: La APOENZIMA se encarga de proporcionar la estructura espacial específica que permite la unión a los sustratos y los COFACTORES son los componentes que llevan a término la reacción propiamente dicha.
1.-ENZIMAS .2.-HOLOENZIMA .2.1.-APOENZIMA (parte proteica) .2.2.-COFACTOR .2.2.1.-Iones metálicos (activadores enzimáticos) .2.2.2.-Moléculas orgánicas .–COENZIMAS (Se unen únicamente durante la reacción enzimática). —GRUPOS PROSTÉTICOS
Estos COFACTORES pueden ser: Iones metálicos:Se les denomina también activadores enzimáticos.Deben encontrarse en determinado estado de oxidación y no se modifican durante el transcurso de la reacción química.Moléculas orgánicas:Según el tiempo que permanece su unión a la parte proteica del enzima, pueden ser: —COENZIMAS: Se unen únicamente durante la reacción enzimática.–GRUPOS PROSTÉTICOS: Permanecen unidos a la apoenzima después de la reacción.———…..—–¨La reacción catalizada consta de tres etapas:–El SUSTRATO se une a la APOENZIMA formando el complejo enzima-sustrato.–Esta unión es reversible (por ello, es la parte más lenta de la reacción ya que una parte del complejo enzima-sustrato se disocia) y muy específica. E + S ES .–La unión de los radicales de los aminoácidos del centro activo al sustrato consigue debilitar los enlaces y provoca cambios energéticos que permiten conseguir más fácilmente el estado de transición.–Una vez formado el complejo enzima-sustrato, el cofactor lleva a término la reacción y se obtiene el producto final (P).–Esta etapa es muy rápida e irreversible.–Si no participan cofactores, la acción catalítica la realizan algunos aminoácidos del centro activo.–El producto se libera del centro activo y el apoenzima queda libre para unirse a nuevas moléculas del sustrato. El coenzima puede liberarse intacto o modificado.
1.4 NOMENCLATURA:
Inicialmente las enzimas recibían el nombre que: –arbitrariamente le asignó su descubridor o –añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato sobre el cuál la enzima ejerce su acción, por ejemplo, la ureasa. —-…—-.A medida que aumento su número, se recurrió a una nomenclatura que diera información sobre la función que realiza la enzima así como sobre los sustratos sobre los que actúa.-.-.Así pues, el NOMBRE SISTEMÁTICO de una enzima consta de TRES PARTES:–la primera parte hace referencia al substrato preferente del enzima, la molécula o grupo de moléculas que son catalizadas por el enzima;–la segunda parte hace referencia a la acción catalítica que efectúa el enzima, es decir que reacción va a sufrir el substrato;–y acabando con la terminación -asa que nos indica que esta molécula es un enzima..-.-.Sustrato sobre el que actúa + acción + terminación asa preferentemente.(Ejemplos: triosafosfato-isomer-asa; alanina-aminotransfer-asa).———……——Cuando la enzima debe ser identificada de forma inequívoca, se utilizan las letras EC (Enzyme Commission) y un número de clasificación que consta de cuatro cifras separadas por puntos de los cuales, el primero corresponde al grupo al que pertenece el enzima y los siguientes a especificaciones más concretas de tal forma que no puede haber dos enzimas con los cuatro números iguales.
¨Existen isoenzimas con el mismo nombre y EC-nº que se diferencian en el tejido del que proceden y la localización interior/exterior de la célula así como en sus propiedades físico-químicas con lo cuál debemos indicar su procedencia.——-……——Cuando la enzima debe ser identificada de forma inequívoca, se utilizan las letras EC (Enzyme Commission) y un número de clasificación que consta de cuatro cifras separadas por puntos de los cuales, el primero corresponde al grupo al que pertenece el enzima y los siguientes a especificaciones más concretas de tal forma que no puede haber dos enzimas con los cuatro números iguales.-.-.-.-.Existen isoenzimas con el mismo nombre y EC-nº que se diferencian en el tejido del que proceden y la localización interior/exterior de la célula así como en sus propiedades físico-químicas con lo cuál debemos indicar su procedencia.——-….—–.Por ejemplo, la enzima tripéptido aminopeptidasa tiene el código EC 3.4.11.4 cuyos componentes indican los siguientes grupos de enzimas:–¨EC 3 son enzimas hidrolasas (enzimas que utilizan el agua para romper otra molécula) –¨EC 3.4 son hidrolasas que actúan sobre los enlaces peptídicos (peptidasas)–¨EC 3.4.11 son las hidrolasas que cortan el grupo aminoterminal de un polipétido (aminopeptidasas).–¨EC 3.4.11.4 son las que unirán el extremo aminoterminal de un tripéptido (tripeptido aminopeptidasas).1.5 CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS:Atendiendo a la ACCIÓN que realizan los enzimas distinguimos seis grupos: 1. Óxidorreductasas 4. Liasas 2. Transferasas 5. Isomerasas 3. Hidrolasas 6. Ligasas o sintetasas.
.1.6 PROPIEDADES:SENSIBILIDAD AL pH:Las enzimas, como proteínas que son, poseen grupos químicos que pueden IONIZARSE -carga eléctrica positiva, negativa o neutra- según el pH del medio que, a su vez, afecta a la conformación de la enzima. Por tanto, las enzimas, a un pH óptimo, presentan la estructura más adecuada para realizar su actividad.-.-.En general, las enzimas son muy sensibles a cambios en el pH por lo que en el organismo existen un conjunto de mecanismos destinados a mantener el pH del medio extracelular en un valor óptimo de 7,42. Por el mismo motivo los reactivos que se utilizan en el LAC contienen soluciones tampón que mantengan el pH en sus valores más adecuados durante el transcurso de las determinaciones.SENSIBILIDAD A LA TEMPERATURA:El aumento de la temperatura incrementa la velocidad de la reacción debido a que se favorece el contacto entre la enzima y el sustrato: por cada 10º C de aumento la velocidad de la reacción se duplica. Si la temperatura aumenta en exceso se produce la desnaturalización de la proteína y con ello pierde progresivamente la actividad catalítica hasta anularse.ESPECIFICIDAD:Es la capacidad de los enzimas para actuar sobre un determinado sustrato. Puede ser: —ABSOLUTA: La enzima solo actúa sobre un sustrato. Por ejemplo: ureasa.–DE REACCIÓN: La enzima cataliza un mismo tipo de reacción sobre distintos sustratos, pero estos tienen alguna característica común. Por ejemplo, las lipasas catalizan reacciones de hidrólisis de ésteres de ácidos grasos.–ESTÉREO-ESPECÍFICA: Actúan sobre sustratos que presentan una determinada configuración espacial. COFACTORES:Algunas enzimas requieren para realizar su función la presencia de cofactores.-.-.Frecuentemente actúan como aceptores temporales de un fragmento de sustrato y los transporta hasta otro enzima o sustrato. MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:Los enzimas no siempre realizan su función a la misma velocidad. Los factores que modifican la actividad enzimática son:-Temperatura -pH -Concentración del sustrato -Cofactores -Concentración de los productos finales -Inhibidores competitivos y no competitivos.-.-.PROENZIMAS: Algunos enzimas se sintetizan en forma de proenzimas. Únicamente cuando mediante un proceso de hidrólisis son liberados uno o varios péptidos, se producirá la reorganización espacial del resto de la proteína adquiriendo las propiedades enzimáticas de la misma. Por ejemplo, el tripsinógeno se sintetiza en el páncreas adquiriendo su actividad proteolítica en el duodeno al transformarse en tripsina..-.-.ISOENZIMAS: Algunos enzimas presentan estructuras moleculares diferentes pero catalizan la misma reacción. Estos enzimas se denominan isoenzimas. Su importancia radica en su utilidad como:–marcadores genéticos: Ej. colinesterasa sérica–marcadores muy específicos de lesión tisular o celular: Ej. creatínquinasa.-.-.-.Por ejemplo, la enzima lactato deshidrogenasa:-cataliza la reacción. Lactato Piruvato:Está constituida por 4 subunidades formadas por cadenas de dos tipos: M (muscle) y H (heart).Mediante electroforesis podemos identificar cinco isoenzimas que corresponden a la asociacion de las cadenas M y H.-.-.La CREATÍNA QUINASA (CK) está formada por dos subunidades: M (muscle) y B (brain) y presenta tres isoenzimas: CK-BB, CK-MB y CK-MM y cuyas localizaciones son respectivamente cerebro, corazón y músculo esquelético.-.-.-.La creatina quinasa cataliza la producción de FOSFOCREATINA a través de la fosforilación de una molécula de creatina, consumiendo una molécula de ATP en el proceso. La molécula de ADP formada para crear una molécula de fosfocreatina se convierte inmediatamente en ATP por las mitocondrias.-.-.La CK puede fugarse del interior de las miofibrillas de un músculo deteriorado. Cuando se encuentran niveles elevados de creatina quinasa en una muestra de sangre indica generalmente que el músculo está siendo destruido por algún proceso anormal, tal como una DISTROFIA MUSCULAR o una inflamación. Sin embargo, existen ciertas condiciones como la fiebre o el esfuerzo muscular que pueden arrojar altos niveles sanguíneos de creatina quinasa sin patología aparente.-.-.Cada isoforma tiene una función diferente: la isoforma CK-BB sirve para conocer el daño cerebral y CK-MB en valores anormales nos permite identificar un daño cardíaco, en especial un infarto de miocardio agudo en combinación con un ECG y estudios de tropomiosinas.1.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA:Al iniciarse una reacción enzimática, el enzima ofrece su centro activo al sustrato formando un complejo enzima-sustrato hasta que se produce la liberación del producto sin que se haya producido alteración alguna del enzima que puede iniciar una nueva reacción.-.-.La velocidad de la reacción, manteniendo constantes las condiciones de la reacción -pH, temperatura, cofactores y concentración de la enzima- es mayor cuanto mayor sea la concentración del sustrato hasta el momento en que se alcanza la velocidad máxima, a partir del cuál aunque aumente el sustrato ya no se supera esa velocidad que se mantiene constante.-.-..Si representamos gráficamente la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración del sustrato, observamos que al inicio de la misma la velocidad es proporcional a la concentración de sustrato, sigue una.CINÉTICA DE PRIMER ORDEN:Cuando se alcanza la velocidad máxima, el aumento de la concentración del sustrato ya no provoca un aumento de la velocidad debido a que se ha producido la saturación de la enzima que interviene en la reacción y dependerá únicamente del tiempo que necesita la enzima para transformar el sustrato. La curva sigue entonces una CINÉTICA DE ORDEN O. -.-.-.–…¨En el LAC cuando se determina la ACTIVIDAD ENZIMÁTICA se mide la VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN catalizada por un enzima en unas condiciones óptimas -pH, temperatura, cofactores etc.- y con EXCESO DE SUSTRATO, es decir aquellas en las que la enzima actúa a su velocidad máxima -cinética de orden O- en la cual la velocidad de reacción es lineal con el tiempo independientemente de la concentración de sustrato, siendo directamente proporcional a la concentración del enzima.-.-.-.-..Por tanto, SE MIDE no la enzima propiamente dicha sino la DESAPARICIÓN DEL SUSTRATO o la APARICIÓN DE LOS PRODUCTOS FINALES debidos a la acción del enzima.-.-.-.-.Estas mediciones se realizan mediante un fotocolorímetro o un espectrofotómetro y en condiciones estandarizadas para que la concentración del enzima en la muestra sea el único factor que afecte a la reacción hasta que se produce el agotamiento del sustrato y la reacción deje de ser lineal -límite de linealidad-.UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:Las cantidades de enzimas pueden ser expresadas en:-CONCENTRACIONES: moles/unidad de volumen… como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.-.-.La ACTIVIDAD ENZIMÁTICA es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones de pH, temperatura…que deben ser especificadas.-.-.La actividad enzimática expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo.-.-..-La unidad de Actividad Enzimática (AE) es la Unidad Internacional (UI) y es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un micromol de sustrato por minuto a 25ºC. -.-.-..1 UI = 1ìmol sustrato convertido x min .2. SIGNIFICADO DE LAS ENZIMAS PLASMÁTICAS O APARICIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS FISIOLÓGICAS EN EL TORRENTE CIRCULATORIO:Por una parte, hay enzimas plasmáticas específicas como son la protrombina y la proacelerina que se encuentran presentes en sangre en una cantidad determinada e intervienen en la cascada de la coagulación.-.-.-.Por otra parte, las actividades enzimáticas fisiológicas de otros enzimas que podemos determinar en sangre se mantienen en unos niveles muy bajos y constantes que pueden aumentar por 3 motivos: actividad muscular, renovación tisular de los tejidos y por aumento de la secreción de los órganos productores.-.-.La aparición en el torrente circulatorio va a depender de 2 factores: de la permeabilidad celular y la distancia a los capilares. Esto va a provocar que se produzca un mayor o menor DESFASE entre el momento en que se produce el daño celular y la detección del aumento de la actividad enzimática del enzima en el suero.-.-.-.Cuando hay un aumento de enzima en la sangre, existen sistemas encargados de captarlas, metabolizarlas y eliminarlas (ej. Los macrófagos del SRE), por lo tanto el nivel alto permanece un tiempo limitado en sangre.-.-.-.Así pues, conociendo la procedencia del enzima (célula, tejido….), su distribución y difusión por la sangre y su vía de eliminación podremos hacer un estudio del fenómeno patológico y su posterior evolución.3. ENZIMAS MÁS IMPORTANTES:a) FOSFATASAS:–Alcalina (ALP)( EC 3.1.3.1): se encuentra en casi todos los tejidos. Es un marcador muy sensible de la enfermedad obstructiva hepática, pero no es específica porque aumenta también en enfermedades óseas de origen osteoblástico y en situaciones fisiológicas como el embarazo y el crecimiento.–Ácida (ACP) (EC 3.1.3.2): Está presente en muchos tejidos, pero la glándula prostática es la que tiene mayor cantidad, después en orden decreciente se encuentra también en hígado, bazo, riñón, eritrocitos, osteoblastos. La isoenzima prostática se utiliza como marcador tumoral en los carcinomas metastáticos de próstata.b) CREATININ-QUINASA (CK) (CPK) (EC 2.7.3.2): Es una enzima citoplasmática y mitocondrial distribuida por todos los tejidos y de forma decreciente en músculo esquelético, miocardio, placenta y cerebro.-.-.-Formada por dos subunidades la M y la B origina 3 isoenzimas:__MM que predomina en el músculo esquelético y miocardio,__MB que predomina en miocardio y la__BB que predomina en cerebro.c) TRANSAMINASAS:–Aspartato aminotransferasa (AST) (EC 2.6.1.1): también se le conoce como GOT. Está presente en el corazón, hígado, músculo esquelético y riñón.–Alanin aminotransferasa (ALT) (EC 2.6.1.2):Se le conoce como GPT. Está en mayor concentración en hígado y en menor concentración en el miocardio.d) GAMMA GLUTAMIL TRANFERASA (¥-GT) (EC 2.3.2.2):Se encuentra principalmente en el riñón, páncreas, hígado y próstata.-Es una enzima microsómica, por lo que el alcohol y ciertos fármacos son capaces de producir una inducción enzimática y por lo tanto un aumento de su nivel sérico.-Se utiliza para evaluar en la deshabituación de los alcohólicos, si estos consumen o no alcohol.Microsomas: No corresponden a una estructura celular definida y está formada por porciones de orgánulos como las membranas mitocondrial, RE, Aparato de Golgi y del citoplasma (formaciones vesiculares o tubulosas) que contienen citocromo P450 (CYP) con función oxidasa (actúa sobre drogas-paracetamol- y componentes tóxicos del organismo -bilirrubina).e) LACTATO DESHIDROGENASA (LDH):Es abundante en el miocardio, riñón, hígado y músculo.–Posee 2 subunidades: H (corazón) y M (músculo), lo que hace que se diferencien 5 isoenzimas:–LDH1 y LDH 2 presentes en el miocardio, hematíes y riñón, –LDH 4 y LDH 5 presentes en hígado y músculo esquelético.-.-.Su concentración de mayor a menor en un suero normal es LDH2, LDH1, LDH3, LDH4, LDH5.f) ALFA-AMILASA:-En condiciones fisiológicas normales se produce en el páncreas exocrino y las glándulas salivares para facilitar la digestión del almidón.–Se filtra fácilmente por el glomérulo por lo que se puede observar en orina.–Posee 2 isoenzimas: P pancreático y S salivar.4. UTILIDAD DE LAS ENZIMAS EN EL LAC:Las enzimas pueden utilizarse como:REACTIVOS EN TÉCNICAS ANALÍTICAS:Actúan como AUXILIARES DEL MÉTODO ANALÍTICO, siendo más específicas que otros métodos químicos tradicionales a los que han desplazado en la práctica. Por ejemplo, la determinación de la glucosa por métodos enzimáticos (glucosa-oxidasa, hexoquinasa).-.-.En otras ocasiones, el producto de una primera reacción enzimática no resulta fácilmente cuantificable de forma directa. En estos casos se utilizan una serie de enzimas que actúan secuencialmente utilizando como sustrato el producto de la reacción anterior y, en muchas ocasiones, la reacción final consiste en el paso del nucleótido NAD+ a su forma reducida NADH + H+ o viceversa. La aparición o desaparición del NADH + H+ se mide mediante un espectrofotómetro permitiendo la cuantificación de la sustancia problema.-.-.Estas determinaciones no son cinéticas porque no miramos la variación del producto con respecto al tiempo.