1. Conceptos de Ácido y Base
Existen muchas sustancias que, al disolverse en agua, modifican la concentración de H+ y OH– de la disolución.
Las sustancias que aumentan la concentración de H+ se denominan ácidos, y las que aumentan la concentración de OH–, bases.
Un ácido produce H+ y una base OH–, por lo que ambos pueden neutralizarse entre sí, originando agua y una sal. Por ejemplo:
HNO3 + NaOH ↔ NaNO3 + H2O
1.1. Teoría de Arrhenius
Arrhenius, en 1897, dio la primera definición útil basada en que una serie de sustancias en disolución acuosa experimentan una rotura en iones positivos y negativos (se ionizan).
En esta teoría, formuló las siguientes definiciones para ácidos y bases:
- Ácido: es toda sustancia capaz de ceder protones (H+) al agua.
- Base: es toda sustancia capaz de ceder hidróxilos (OH–) al agua.
Ácido: es cualquier sustancia que en solución acuosa se disocia produciendo iones hidrógeno, H+.
Base: es cualquier sustancia que en solución acuosa se disocia produciendo iones hidróxido, OH–.
Esta teoría tiene el inconveniente de que solo se puede aplicar a disoluciones acuosas.
1.2. Limitaciones de Arrhenius y la Reacción de Neutralización
La reacción de neutralización consiste en la combinación del ión H+ del ácido con el ión OH– de la base, para dar agua no disociada.
Esta teoría presenta considerables LIMITACIONES, ya que, según Arrhenius:
- La característica ácido/base depende de la presencia del agua como disolvente, pero en la realidad se conocen muchas sustancias que se comportan como ácidos o bases en ausencia de agua.
- También encontramos sustancias que presentan carácter ácido a pesar de no tener hidrógeno en su molécula (ej. CO2, SO3, etc.) o sustancias con carácter básico a pesar de no contener en su molécula iones hidróxido (ej. Na2CO3 -carbonato de sodio- etc.).
1.3. Teoría de Brönsted y Lowry
Brönsted y Lowry mejoran la teoría, ampliándola a todos los disolventes.
- Ácido: es toda sustancia, molecular o iónica, capaz de ceder protones.
- Base: es toda sustancia, molecular o iónica, capaz de captar protones.
La reacción de neutralización consiste en la transferencia de un protón de un ácido a una base, lo que origina el ácido conjugado de la base y la base conjugada del ácido. Ej. HCl + H2O ↔ H3O+ + Cl–
Esta teoría amplía considerablemente el concepto de ácido-base de Arrhenius; sin embargo, es todavía restringida en un aspecto importante: solo puede aplicarse a las reacciones en que haya transferencia de protones. El modelo ácido-base de Lewis elimina esta restricción.
1.4. Teoría de Lewis
En 1923, Lewis propuso una nueva definición:
- Ácido: es aquella sustancia capaz de aceptar un par electrónico.
- Base: es una sustancia dadora de un par electrónico.
El ácido debe tener su octeto de electrones incompleto y la base debe tener algún par de electrones solitarios.
La regla del octeto, enunciada en 1917 por Lewis, dice que la tendencia de los iones de los elementos del sistema periódico es completar sus últimos niveles de energía con una cantidad de 8 electrones de tal forma que adquiere una configuración muy estable.
El protón, H+, según esta definición, es un ácido de Lewis ya que tiene vacío el orbital 1s, en donde alojar el par de electrones.
El amoníaco, NH3, es una base de Lewis típica. El amoniaco actúa como una base de Lewis al donar un par de electrones al agua, transferencia que lleva a su hidrólisis en oxhidrilo y protón, que es recibido por el amoníaco para formar amonio.
NH4+ ↔ H+ + NH3
Las bases así definidas tienen el mismo sentido que las que habían dado Brönsted y Lowry, pero esta definición para los ácidos ampliaba el número de sustancias que se comportaban como tales, por ejemplo, los cationes (+), sustancias que tienen un átomo con el octeto incompleto (faltan electrones).
El AlCl3 es un ácido de Lewis ya que acepta electrones, como por ejemplo del Cl–.
Por tanto, la relación entre un ácido y una base es:
Ácido ↔ H+ + base
1.5. Sustancias Anfóteras o Anfifróticas
Anfóteras o anfipróticas son aquellas sustancias que en ocasiones se comportan como ácidos y en otras como bases. El agua, al ionizarse, adquiere propiedades tanto ácidas como básicas, es, por tanto, una sustancia anfótera.
H2O ↔ H+ + OH–
Cuando un ácido cede protones, se convierte en un compuesto capaz de aceptarlos (en una base), por lo que lo denominamos base conjugada.
Ácido ↔ H+ + base conjugada
Cuando una base acepta protones, se convierte en una sustancia capaz de cederlos (en un ácido), por lo que la llamaremos ácido conjugado.
Base ↔ H+ + ácido conjugado
Igualmente, se aprecia la idea de que las sustancias NO pueden ser obligatoriamente bases o ácidos, ya que dependiendo de las sustancias con las que están en contacto se comportan de una u otra forma.
2. Fuerza de los Ácidos y de las Bases
Si intentamos medir la fuerza de un ácido, diríamos que sería la tendencia a ceder protones, y que dependerá de la especie con que se combine para aceptarlos.
De la misma manera, si queremos medir la fuerza de una base, ésta sería la tendencia a captar protones, y dependerá de la especie que se combine para cederlos.
Cuanto mayor es la facilidad con que el ácido cede el protón, más fuerte es, y tanto más débil su base conjugada. Lo mismo podríamos decir con la base.
Los ácidos fuertes se ionizan completamente en las soluciones acuosas diluidas, a causa de su tendencia a ceder protones. Ej. HCl, HBr, etc.
Los ácidos débiles solo se ionizan parcialmente, a causa de su débil tendencia a ceder protones; de esta manera, se establece un equilibrio entre las moléculas no ionizadas e iones formados. Ej. HNO2, etc.
La constante de equilibrio K es una expresión de las concentraciones del equilibrio de las moléculas o iones en solución.
La constante de disociación ácida Ka es el valor numérico igual a la concentración de los productos, dividida por la concentración de los reactantes, donde el reactante es el ácido (HA) y los productos son la base conjugada y H+.
Las bases fuertes muestran una gran tendencia a recibir protones de los ácidos. Ej. LiOH, CsOH, etc.
Las bases débiles tienen poca tendencia a recibir los protones; de esta manera, se establece un equilibrio entre las moléculas no ionizadas y los iones que se han formado. Ej. NH3.
3. Concepto de pH
3.1. Autoionización del Agua
El agua es la biomolécula más abundante debido a que el medio interno es esencialmente acuoso.
La inmensa mayoría de las reacciones bioquímicas se desarrollan en ella y siguen las leyes físico-químicas de las disoluciones acuosas.
Se ha comprobado que el agua pura presenta una ligera conductividad eléctrica, lo que nos lleva a pensar en la presencia de iones en una cantidad determinada. En efecto, el agua experimenta un proceso de autoionización, en el que algunas moléculas de H2O transfieren un H+ a otras, produciéndose una reacción ácido-base.
El equilibrio iónico que se establece entre el agua y los iones hidrógeno e hidroxilo es muy importante en los seres vivos debido a:
- El gran porcentaje que ocupa el agua en células y tejidos.
- El agua actúa como disolvente y como electrolito en los procesos químicos biológicos.
- Origina una gran cantidad de iones influyendo en las reacciones químicas que suceden en su seno.
3.2. Definición de pH
Para poder definir el pH es necesario estudiar el equilibrio de disociación del agua pura:
H2O + H2O ↔ H3O+ + OH–
H2O ↔ H+ + OH–
El equilibrio químico de esta reacción está desplazado hacia la izquierda de la ecuación, es decir, hacia el agua sin disociar.
En una solución acuosa, la [H2O] es muy grande -55’6 moles/litro- siendo muy pocas las moléculas que se disocian -1 de cada 553 millones-, y lo hacen como iones hidrógeno e hidroxilo a partes iguales.
La constante de equilibrio para la ecuación anterior es:
Ke = [H+][OH–] / [H2O]
Ke[H2O] = [H+][OH–] = Kw
Kw = producto iónico del agua o constante de ionización del agua.
La Kw tiene un valor a 25ºC temperatura de 10-14 molar.
[H+][OH–] = Kw = 10-14 molar
Cuando se trata de agua pura la [H+] = [OH–] ya que se forman en cantidades iguales, por lo tanto:
Kw = [H+][OH–] = 10-14 M [H+] = [OH–] = 10-7 M
Así pues, una disolución neutra es aquella que cuya
[H+] = [OH–] = 10-7 M
Si a la solución acuosa le añadimos un ácido ([H+]), con el fin de mantener el valor de Kw, el equilibrio se desplazará a la izquierda y el ión complementario disminuye (¯ la [OH–]), de tal forma que el producto de las concentraciones se mantiene constante:
Kw = [H+][OH–] = 10-14 M
[H+] > [OH–] [H+] > 10-7 y [OH–] -7
Lo mismo ocurriría si añadiésemos una base:
[H+] -] → [H+] -7 y [OH–] > 10-7
Por lo tanto, podemos saber la acidez o basicidad de una solución midiendo la concentración de hidrogeniones e hidroxilos respectivamente.
Se define el pH como el logaritmo decimal de la inversa de la concentración de hidrogeniones en moles/litro.
pH = log 1 / [H+] = – log [H+]
Si expresamos la concentración de hidrogeniones como potencia de 10, el pH es igual al exponente con el signo cambiado:
[H+] = 10-pH
De esta ecuación podemos deducir que cuanto más bajo es el pH, más ácida es la solución y cuanto más alto más básico será.
Análogamente, podemos deducir:
pOH = -log [OH–]
Cuanto más pequeño es el pOH mayor es la alcalinidad.
Tomando logaritmos en la ecuación Kw = [H+][OH–] = 10-14, tenemos que log [H+] + log [OH–] = -14
Realizamos el cambio de signo y, sustituyendo por definición:
pH + pOH = 14
Si expresamos la concentración de hidrogeniones como potencia de 10, el pH será igual al exponente cambiado de signo.
Ej. Una disolución de un ácido 0.001 M, tiene una [H+] = 10-3, por tanto su pH=3.
En el caso de un álcali, si la [OH–] = 10-3, tenemos que [H+] [OH–] = 10-14, por lo que: [H+] x 10-3 = 10-14 [H+] = 10-14 / 10-3 = 10-11. pH = 11.
3.3. Métodos de Medida del pH
El pH de las disoluciones acuosas se puede determinar experimentalmente mediante el uso de:
3.3.1. Indicadores Ácido-Base: Métodos Colorimétricos
Un indicador es una sustancia química que cambia de color perceptiblemente en un cierto intervalo de pH.
Son colorantes ácidos o básicos (débiles) cuyas bases o ácidos conjugados tienen distinto color -cuando están sin disociar presentan un color y cuando están disociados presentan un color diferente-. Por ejemplo, el rojo de metilo a pH>4.2 es amarillo y a pH
En función del pH del medio, el indicador se comporta como un ácido o como una base, ya que el equilibrio se desplazará en una u otra dirección. El cambio de color está relacionado con el equilibrio iónico entre el indicador y los iones H3O+, donde el indicador se comporta o bien como un ácido o como una base.
InH+ + H2O ↔ H3O+ + In
Pero existe una franja aproximadamente de 2 unidades de pH en que no predomina ninguno de los dos colores, siendo el color resultante una mezcla de ambos; esto se conoce como color neutro del Indicador o intervalo de viraje del Indicador, siendo una característica del mismo.
Por esto surgió la idea de mezclar varios indicadores y crear el Indicador Universal, que abarca todo el espectro del pH y la gama de colores. Pueden ser:
- a) LÍQUIDOS: en este caso, la forma de utilizarlo consiste en añadir unas gotas a la disolución a estudiar.
- b) CONTENIDO EN TIRAS DE PAPEL REACTIVO -PAPEL INDICADOR: consiste en un papel absorbente impregnado de indicador. Para medir el pH con el papel indicador basta con introducirlo en la disolución objeto de estudio y comparar el color resultante con una escala de colores (patrón) que en los preparados comerciales se adjunta al papel indicador. La escala de valores va variando de unidad en unidad de pH, por lo que obtenemos un valor de pH aproximado.
3.3.2. Métodos Potenciométricos: pH-metros
Son unos aparatos que miden la diferencia de potencial que se establece entre dos electrodos: un ELECTRODO DE REFERENCIA y un ELECTRODO INDICADOR DEL PH.
Consiste en una membrana selectivamente permeable a los hidrogeniones – y que dependen de la concentración de hidrogeniones del medio a analizar-.
Los dos electrodos pueden presentarse de forma independiente o integrada formando un electrodo combinado.
Los más utilizados son el de gas hidrógeno, el de quinhidrona y el de vidrio. De los tres, el más utilizado por sus ventajas -fácil manejo, amplio espectro de pH (0-14), no ser atacable por agentes oxidantes y reductores- es el de vidrio.
Basa su funcionamiento en la existencia de una diferencia de potencial que se establece a través de la membrana de vidrio cuando esta se interpone entre dos soluciones con distinta [H+]. Una de estas soluciones tiene con una [H+] conocida y la diferencia de [H+] respecto a la muestra establece la diferencia de potencial que permite determinar el pH.
Manejo del pH-metro
Aunque para manejar un pH-metro hay que seguir las normas e instrucciones indicadas por cada fabricante, existen algunas consideraciones de carácter general a tener en cuenta:
Después de conectar el pH-metro a la red y antes de su utilización:
- Hay que esperar un tiempo de estabilización.
- Se debe hacer un lavado a fondo del electrodo con agua destilada y secarlo suavemente con un paño o papel de filtro procurando no tocar la membrana de vidrio.
- Debido a que el potencial varía con la temperatura, habrá que efectuar la corrección, de forma manual o automática, ya que el valor de pH variará.
El electrodo de vidrio no realiza medidas absolutas de la concentración de hidrogeniones sino relativas, por lo que es imprescindible utilizar soluciones para el calibrado.
Antes de cada serie de medidas debe calibrarse con soluciones de pH conocido (tampones). Normalmente se utiliza un tampón de pH neutro y otro de pH ácido o básico.
La SECUENCIA DEL CALIBRADO es la siguiente:
- Aclarar el electrodo con agua destilada, escurrir y secar suavemente.
- Introducirlo en el tampón de pH 7 agitando ligeramente y ajustar hasta observar el valor 7 en la escala.
- Aclarar el electrodo con agua destilada y escurrir bien.
- Introducirlo en el tampón de pH 4 (u otro) y, si es necesario, ajustar.
- Aclarar el electrodo con agua destilada.
TÉCNICA: Para medir el pH de la muestra problema, la técnica consiste en sumergir el electrodo en la muestra previamente homogeneizada agitando durante unos segundos.
El valor del pH aparecerá directamente en la pantalla del pH-metro.
Entre muestra y muestra deberá aclararse el electrodo con agua destilada.
Después de unas 10 determinaciones, volver a calibrar con el tampón de pH 7.
Después de su utilización, el electrodo debe mantenerse sumergido en una disolución de cloruro potásico o en agua destilada con el selector en posición cero.
3.3.3. Volumetrías. Titulaciones Ácido-Base
Las TITULACIONES, también llamadas valoraciones, son procesos cuya utilidad es determinar con exactitud la concentración de una disolución.
Se basan en las reacciones de neutralización ácido-base.
Cuando hacemos reaccionar un ácido con una base, se obtiene la sal correspondiente y agua, denominándose a este proceso neutralización.
Ácido + base → sal + agua
El ácido y la base reaccionan equivalente a equivalente, es decir, números iguales de equivalentes-gramo de dos sustancias reaccionan exactamente entre sí debido a que un H+ neutraliza un OH–.
HCl + NaOH → NaCl + H2O
4. Soluciones Amortiguadoras
En los seres vivos, cambios bruscos o significativos del pH resultan peligrosos para la vida. Existen soluciones como la sangre que, después de adicionarles una determinada cantidad de ácido o de base, presentan el mismo pH. Ello se debe a unos mecanismos capaces de regular la [H+] denominados sistemas amortiguadores, tampones o búffers.
Las soluciones amortiguadoras se caracterizan por ser capaces de mantener un valor de pH constante debido a que son capaces de liberar o captar H+ manteniendo su concentración estable en el medio aunque se les adicione un ácido o una base en cantidades considerables.
Los componentes fundamentales de un amortiguador son las formas disociada y no disociada de un ácido débil (A) o de una base débil (B):
AH ↔ A– + H+ (acido ↔ base conjugada + hidroxilo)
B– + H+ ↔ BH+ (base + hidroxilo ↔ acido conjugado)
4.3. Tampones Más Comunes
Entre ellos encontramos los que utiliza el cuerpo humano para mantener el pH de sus fluidos biológicos como:
- Ácido carbónico-bicarbonato: CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ HCO3– + H+
- Tampón fosfato: H2PO4– ↔ HPO42- + H+
- Hemoglobina: H+ + Hgb– ↔ HHgb
4.4. Aplicaciones en la Química Analítica
Una de las aplicaciones más importantes es en las técnicas electroforéticas. La electroforesis es una técnica que sirve para separar y purificar proteínas; el éxito de una electroforesis depende de una regulación muy exacta del pH, por lo que se tiene que utilizar un tampón.
Refractometría
1. Principios Físicos de la Refractometría
La refracción de la luz es el fenómeno físico que se produce cuando un haz de luz pasa desde un medio hacia otro de diferente densidad. El haz de luz incidente experimenta un cambio en su dirección al pasar por la superficie que separa ambos medios. El ángulo formado por el rayo incidente y la normal se denomina ángulo de incidencia y el formado por el rayo refractado, ángulo de refracción.
Generalmente n es mayor que 1 ya que el ángulo de incidencia es mayor que el de refracción.
El índice de refracción varía con la temperatura y con la longitud de onda del haz de luz. Si estos factores se mantienen constantes, el índice de refracción es característico y constante para cada medio, siendo su valor directamente proporcional a la cantidad de sustancias disueltas; por ello, se utiliza para calcular la concentración de solutos en una solución.
La refractometría es la técnica que mide el índice de refracción y tiene una aplicación práctica en:
- Identificación de sustancias.
- Determinar la concentración de solutos.
- Determinar el peso específico.
En el LAC se utiliza para medir la concentración de proteínas en suero o plasma (principalmente la albúmina) y el peso específico de la orina, aunque en la actualidad se emplea poco ya que los parámetros que obtenemos se encuentran en otros sistemas de análisis o bien más sencillos como las tiras reactivas o automatizados como los autoanalizadores.
2. El Refractómetro
Son instrumentos utilizados para la determinación del índice de refracción.
Para pequeñas cantidades de muestra se utiliza el llamado refractómetro de Abbe, que consta de dos prismas rectangulares de vidrio, uno de los cuales puede girar mediante una charnela de forma que sus caras hipotenusas puedan juntarse o separarse a voluntad.
Entre ambas caras se coloca 1 ó 2 gotas de muestra. Los rayos luminosos de la fuente de luz atraviesan el prisma «fijo»; parte de los rayos, después de atravesar la muestra, inciden sobre el prisma «móvil», refractándose y saliendo del prisma con un ángulo cuya medición se efectúa con un anteojo telescópico. Por el ocular observamos una zona del campo oscura y otra clara. El punto de intersección en la escala graduada será el índice de refracción.
No hay que olvidarse calibrar el aparato con agua destilada y ajustar a 0 las zonas del campo de visión mediante el destornillador.
Básicamente los refractómetros están compuestos por las siguientes partes:
- Fuente luminosa: fuentes de radiación visible.
- Sistema de compensación de la temperatura: Los líquidos sufren cambios en su índice de refracción en relación con la temperatura.
- Prisma de refracción: Están construidos por cristales con alto índice de refracción. Su forma puede ser triangular, rectangular o trapezoidal. La muestra se deposita sobre el prisma. Por ello, los refractómetros están cubiertos por una capa de goma que evita el paso de calor desde la mano del técnico a la muestra.
- Equipo óptico: Formado por un equipo de lentes que permite enfocar la luz procedente del prisma.
- Sistema de lectura: Consiste en una escala graduada sobre la que incide la luz procedente del prisma apreciándose una línea de separación – a veces con separación de colores- que facilita la lectura. La escala de lectura está graduada para determinar niveles de proteínas en suero/plasma y el peso específico de la orina.
2.1. El Refractómetro Clínico
Es el instrumento utilizado para determinar la concentración de sustancias disueltas en una disolución acuosa midiendo el índice de refracción.
El refractómetro clínico tiene tres escalas:
- Proteínas en suero: en g/100 mL.
- Índice de refracción: adimensional.
- Densidad de la orina.
2.2. Refractómetro Grados Brix, ºBR
Para medir azúcares contenidos en sustancias muy diversas: zumos de fruta y otras bebidas, productos alimentarios, disoluciones glucosadas.
La medida se realiza en grados Brix. Esta nomenclatura mide el cociente de azúcar que hay en una disolución. Si tenemos 18ºBx de un determinado azúcar en una disolución, significa que hay 18 g de azúcar por cada 100 g de agua o disolvente.
Con la ayuda de tablas tabuladas y con la medida de los grados Brix, podemos determinar la densidad de una sustancia y su índice de refracción.
3. Práctica: Determinación de Proteínas en Suero
3.1. Preparación del Refractómetro
- Abrir la placa que cubre el prisma.
- Limpiar la placa y el prisma con un paño suave para evitar rayar la superficie.
- Dirigir el prisma hacia la luz.
- Ajustar el anillo de dioptrías para apreciar claramente la escala graduada.
3.2. Calibrado
Dos posibilidades:
a) Con agua desionizada:
- Se coloca una gota (50 microlitros) de agua en el centro del prisma y se cierra la tapa.
- Esperar un momento para que el agua se distribuya sobre la superficie del prisma.
- Situar el refractómetro hacia la luz. Con ello mejoramos la visualización de la línea de separación sobre la escala.
- Enfocar la escala girando el ocular.
- Mirar por el ocular y girar el tornillo de ajuste hasta que la línea de separación se sitúe sobre la línea de calibración del agua (Wt). Esta calibración servirá tanto para determinación de niveles de proteínas como de peso específico de la orina.
- Se limpia el prisma con un paño húmedo y posteriormente seco.
b) Mediante soluciones estándar de baja y alta concentración de la misma sustancia a medir: El proceso es el mismo pero ajustando con el tornillo a los valores indicados para cada uno de los estándares utilizados.
3.3. Determinación de los Niveles de Proteína en Suero
- Situar en el centro del el prisma una gota de suero cerrando la placa situada sobre el prisma.
- Esperar unos momentos hasta que el suero se desplace sobre la superficie del prisma.
- Dirigir el refractómetro hacia la luz para visualizar lo más cómodamente posible la línea de separación en la escala graduada.
- Enfocar la escala girando el ocular.
- Leer sobre la escala de concentraciones los niveles de proteínas.
- Si la temperatura es diferente a la del momento en que se realizó la calibración, proceder a la corrección del valor obtenido. Podemos hacerlo sumando/restando 0,1 por cada grado que la temperatura es superior /inferior a 20 ºC.
Observación: En las determinaciones de peso específico de la orina los valores obtenidos son ligeramente inferiores (0,02 unidades menos) a los obtenidos por otras técnicas como el urinómetro o las tiras reactivas.