Extracción de lípidos
Utiliza el procedimiento de folch que usa
Una mezcla de cloroformo y metanol. Los lípidos son solubles en cloroformo,
Este se elimina recuperando los lípidos
.
Extracción de ADN
Se añade una solución de lisis que degrada proteínas y
ARN, centrifugar y en la
fase acuosa se encuentra el ADN, añadimos etanol para
Que precipite por ser insoluble en él, centrifugar y en el precipitado se
Encuentra en ADN genómico de gran pureza
.
Extracción de proteínas
Centrifugar para
separar proteínas solubles de las
Unidas a las membranas, después mediante precipitación salina se separan las
Proteínas concretas aumentando la fuerza iónica del medio.
Propulsoras:
Flujo del
disolvente:
si la
sustancia cromatografiada fuera completamente soluble en
El disolvente y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascendería desde el
Origen hasta donde llega el diluyente, si la sustancia fuera insoluble en el
Disolvente en movimiento no se movería del origen.
Solubilidad: en la corriente del disolvente es una fuerza
propulsora que tiende a desplazarla manteniéndola en movimiento a lo largo del
Papel.
Retardantes:
adsorción: la celulosa de la que está
Hecho el papel de filtro puede adsorber, unas sustancias son más adsorbidas que
Otras, las sustancias más adsorbidas quedan atrás mientras que las menos
Avanzan.
Reparto: presencia de dos
Fases líquidas individuales, una de ellas es la corriente del disolvente
Circulando por el papel de filtro la otra es la fase acuosa contenida en el
Papel también, contiene entre un 6 y 12% de agua adherida a la celulosa, cuando
Una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es expuesta el
Mismo tiempo a ambos se reparte entre ellos, la cantidad que se encuentre en
Cada disolvente depende de la solubilidad del soluto en cada uno.
C. Intercambio iónico:
se realiza sobre
Matrices que tienen una carga neta positiva, la carga de la matriz de la
columna y la de las proteínas dependerá del ph del solvente y de su fuerza
Iónica, en unas condiciones determinadas son retenidas en la columna las proteínas
Que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel, siendo eluídas
El resto, para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica
Del solvente o el ph alcanzando el punto isoeléctrico de la proteína de interés
O el de la matriz, neutralizando la fuerza que retiene a las proteínas en la
Columna.
C. Filtración en gel:
Se
Usan unas matrices formadas por unas esferas porosas, las moléculas pequeñas
Penetran en los pequeños conductos que presentan las bolas de gel donde la
Velocidad de flujo de solvente es menor, las moléculas grandes incapaces de
Penetrar en los pequeños conductos de las bolas de gel se mueven entre ellas,
Donde la velocidad de flujo de solvente es superior, consecuencia las moléculas
De mayor peso molecular son eluidas antes que las de menor
. C. De gases:
la separación de los componentes gaseosos se produce
Por adsorción selectiva sobre un sólido o por
reparto entre un gas inerte y un
Liquido no volátil que forma la fase estacionaria, los componentes del gas
Problema son sostenidos por un sólido absorbente colocados en una columna
Metálica, el gas problema se inyecta en la corriente de un gas inerte que le
Conduce hasta la columna y que hace la fase móvil, en la distribución de los
Componentes del problema entre el gas portador y el sólido absorbente se
Verifica una separación por lo que emergen de la columna a distintos tiempos
Pasando al final por un detector que los identifica. En la cgl la fase
Estacionaria es un líquido no volátil absorbido en un soporte sólido que
Rellena la columna, los componentes del gas problema son desplazados por el gas
Portador, los componentes de la muestra se separan de acuerdo con los
Coeficientes de reparto entre las dos fases. Instrumentación: la cromatografía
Necesita un montaje complejo, sistema cerrado y controlar caudales, presión y
Temperatura, fases móviles: H, He, N y aire, fase estacionaria: en cgs carbón
Alúmina, silicagel y tamices moleculares, en cgl sólido soporte adsorbente y un
Líquido no volátil, detectores: muchos tipos, actúan siempre por comparación de
Alguna propiedad física o química del gas portador solo y de la mezcla de gas
Portados y componentes problemas.
Descenso
Crioscópico:
disminución del punto de congelación de
Un disolvente cuando un soluto se encuentra disuelto en él.
Rf:
distancia recorrida por el
Compuesto desde el origen entre distancia recorrida por el frente del
Disolvente.
Ácido-base según b-l:
un
ácido es cualquier especie capaz de donar un protón y base capaz de captarlo.
Volumen muerto de una columna
Cantidad
De solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha
Reemplazado completamente.
Ascenso
Ebulliscópico
Aumento de la tª de ebullición del disolvente líquido cuando
Contiene un soluto. Matriz de columna: sustancia empapada de solvente y que se
Empaqueta en la columna. Longitud de columna: longitud del dispositivo en el
Que se empaqueta la columna, volumen de la columna: volumen total de gel que se
Empaqueta en una columna cromatográfica, run throught: volumen de solvente +
Proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.
Mecanismos cromatografía
adsorción: gases o líquidos contenidos
En la fase móvil son retenidos por una adsorción selectiva en la superficie del
Sólido que constituye una fase estacionaria
,
Reparto: los componentes de la fase móvil son retenidos por la fase
Estacionaria liquida en función de su solubilidad en ella
, intercambio iónico: fase estacionaria formada por un sólido
Intercambiando iones con iones contenidos en la fase móvil,
tamaño molecular: especies neutras de
Alto peso molecular pueden ser separadas por su tamaño donde la fase
Estacionaria es un gel hidrofílico altamente poroso que retiene las moléculas
De menor tamaño al de los poros
,
Migración eléctrica: los componentes iónicos son separados por su diferente
Velocidad y sentido con que se desplazan en un campo eléctrico.
C. En papel:
papel de filtro en uno de
Los extremos se deposita una gota de solución que contiene la mezcla de las
Sustancias que se quieren separar. Se deja secar la gota y quedará la mancha de
Las sustancias, el extremo del papel más próximo a la mancha se introduce en un
Disolvente pero sin que la mancha llegue a introducirse en él
, ascendente: el disolvente se encuentra
En el fondo del recipiente que sostiene al papel y va subiendo a través de el
Por capilaridad,
descendente: el
Disolvente está en un recipiente del que cuelga el papel y va subiendo a través
Del el por capilaridad y gravedad, en los dos casos el disolvente avanza por el
Papel pasando por encima de la mancha al avanzar se disuelve y arrastra las
Sustancias de la mancha cada una de ellas se mueve a distinta velocidad que
Otras, se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y
Se observan las sustancias separadas si tienen color o en caso de no tenerlo se
Revela por una reación química apropiada, esta técnica se conoce como
Cromatografía monodimensional.
C. Capa
Fina:
Se deposita una capa uniforme muy delgada de una sustancia absorbente
En la cromatoplaca, los cromatogramas que se obtienen pueden conservarse y
Archivarse si se pulveriza la placa revelada con una dispersión de un plástico
Transparente y especial donde quede grabado el cromatograma sobre la película
Endurecida del plástico que se separa fácilmente del soporte.
C de columna:
Técnica para el
Fraccionamiento de proteínas, consiste en aplicar una muestra compleja de
Proteínas a una columna de cristal en la que se sitúa una matriz sólida porosa
Que está inmersa en solvente, se bombea una gran cantidad de solvente a través
De la columna, las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según
Sus interacciones con la matriz, las
Proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o
Capacidad de unirse a grupos químicos, la pureza de las fracciones obtenidas se
Suele comporbar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
. C. De afinidad:
las bolas de gel
Están recubiertas de un ligando por el que tiene afinidad alguna de las
Proteínas a aislar, al pasar la mezcla a través de la columna esta proteína es
Retenida en la superficie de las bolas, yéndose el resto, para eluir la
Proteína retenida por afinidad se suele aumentar la fuerza iónica de la
Solución de solvente o incluir en éste el ligando soluble a alta concentración
De forma que compita con el que está unido a las bolas de gel por la uníón de
La proteína.
HPLC:
la fase móvil es
Un líquido que fluye a través de un sólido por el efecto de la gravedad para
Alcanzar alta resolución seria necesario emplear columnas largaz, lo que se
Traduciría en un desarrollo muy lentode los cromatogramas, la de alta
Resolución trabaja con pequeñas columnas muy empaquetadas y forzando el paso de
La fase móvil mediante presiones altas, con lo que se consiguen separaciones
Muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo, dependiendo de la fase estacionaria
El mecanismo de separación puede ser reparto, adsorción, tamaño molecular e
Incluso cambio iónico aunque los métodos mas utilizados se basan en el reparto
Y adsorción, el esquema fundamental de un cromatógramo de alta resolución está
Constituido por un depósito y un dispositivo de bombeo de la fase móvil que
Opera a elevada presión, un sistema de inyección de la muestra, columnas
Resistentes rellenas de fase estacionaria, detector y un sistema de registro
Gráfico. La columna y los detectores van introducidos en termostatos, los
Detectores mas utilizados son UV y en medida de índices de refracción.
