Genética del Cáncer y Biotecnología: Mecanismos, Diagnóstico y Tratamiento

Genética del Cáncer

¿Enfermedad Genética o Hereditaria?

El cáncer se considera una enfermedad genética, pero no siempre es hereditaria. Esto depende de si la alteración genética afecta a células somáticas o germinales. Además, los factores ambientales juegan un papel crucial en su desarrollo.

¿Qué es un Tumor?

Un tumor es un crecimiento incontrolado de células dentro de un tejido, formando una masa irregular. Se vuelve maligno cuando afecta la funcionalidad del tejido, generalmente debido al déficit en el suministro de nutrientes, que son robados por las células en continua división. Un tumor maligno puede expandirse a otros tejidos, proceso conocido como metástasis.

Causas y Diagnóstico

La causa principal del cáncer son las alteraciones en el ADN, que conducen a un crecimiento celular incontrolado. El diagnóstico se realiza mediante una biopsia.

Características del Cáncer

Las células cancerosas pierden su forma y límites normales, volviéndose poco definidas y formando una masa celular anormal. Si atraviesan la lámina basal, entran al torrente sanguíneo y se sitúan en nuevos tejidos, se dice que han entrado en metástasis.

Modelo del Cáncer en Etapas de Knudson

Este modelo define el cáncer como resultado de la acumulación de mutaciones. Si las mutaciones son heredables, se necesitarán menos mutaciones para que se desarrolle la enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los tumores provienen de la acumulación de mutaciones somáticas (espontáneas o inducidas) a lo largo de la vida, por lo que son más comunes en edades avanzadas.

Proceso de Desarrollo del Cáncer

1. Una célula normal sufre su primera mutación y comienza a dividirse más rápido que las demás, transmitiendo la mutación a su descendencia.
2. Esto aumenta las probabilidades de sufrir una segunda mutación en una de las células descendientes. Se pierden los controles normales de replicación y aumenta la tasa de replicación.
3. Aumenta aún más la probabilidad de acumular más mutaciones en sucesivas divisiones. Finalmente, la célula se convierte en cancerígena, perdiendo su forma y límites normales, y volviéndose más agresiva o proliferativa.
4. Esta célula maligna se replica y forma una masa celular anormal o irregular que desplaza a las células sanas (que se dividen más lento) y genera el tumor.

Evolución Clonal

El cáncer comienza en una célula normal que sufre una primera mutación y se divide más rápido que las demás. Su descendencia hereda la mutación. El aumento de la replicación aumenta las probabilidades de que ocurran más mutaciones en otra célula, que a su vez las transmite a su descendencia. Se van acumulando mutaciones hasta formar una célula maligna que prolifera y desplaza a las células sanas. La tasa de evolución clonal depende de la frecuencia con la que aparecen nuevas mutaciones.

Oncogenes y Genes Supresores de Tumores

Estos genes regulan el ciclo celular (división celular o replicación). Algunos también juegan un papel en la apoptosis. Una mutación (inducida o espontánea) en estos genes puede acabar generando cáncer, ya que puede incrementar la tasa de replicación celular (hiperactivación de un protooncogén o inhibición de un gen supresor) y a partir de ahí, ir acumulando mutaciones.

A. Oncogenes

Los oncogenes provienen de protooncogenes, que activan la división celular normal mediante la síntesis de factores de estimulación. Una mutación en un alelo del gen tiende a ser dominante y se expresará en individuos heterocigotos para ese gen. Los oncogenes producirán un factor estimulador celular hiperactivo que actúa sobre la célula acelerando la tasa de división. Los virus pueden activar los protooncogenes: lo incorporan a su genoma viral por recombinación, donde puede mutar a oncogén (más probable que de forma normal) y vuelve a ser insertado en la célula.

B. Genes Supresores de Tumores

Los genes supresores de tumores limitan la división celular normal mediante la síntesis de factores de inhibición. Una mutación en un alelo del gen tiende a ser recesiva y no se expresará en individuos heterocigotos (seguirán expresando el factor de inhibición, pero en menor cantidad). Serán necesarias mutaciones en ambos alelos para que dejen de producir el factor de inhibición que actúa sobre la célula acelerando la tasa de división. La pérdida de heterocigosidad ocurre cuando los individuos que tienen un alelo mutado (el otro es dominante y expresa el factor de inhibición) tienen mayor probabilidad de desarrollar una mutación en el otro alelo o que se pierda mediante deleción. Si se genera cáncer solo con un alelo recesivo mutado, se denomina Haploinsuficiencia. Un ejemplo de gen supresor de tumores es el gen p53, mutado en el 75% de los tumores de colon. Este gen regula un potente inhibidor de la actividad CDK. Las mutaciones en genes que regulan la apoptosis también pueden afectar al gen que regula la apoptosis (se activa cuando hay daño en el ADN por mutación), impidiendo que la célula muera y permitiendo que prolifere con la mutación, generando un tumor.

Vías de Transducción de Señales

Estas vías intervienen en el ciclo celular. Permiten que, a partir de una señal externa, se active una cascada de reacciones intracelulares que producen una respuesta como la transcripción, que estimula la expresión de genes. Las señales externas son hormonas y factores de crecimiento, que normalmente no pueden atravesar la membrana celular (por su tamaño o carga) y se unen a receptores en la superficie. Las alteraciones en las vías de transducción pueden generar cáncer, ya que afectan al ciclo celular.

0. La Vía de Ras

La vía de Ras participa en el control del ciclo celular. Se activa por el factor de crecimiento epidérmico (EGF), que actúa como señal externa uniéndose al receptor de la superficie celular. La fracción interna del receptor cambia de conformación y se une a la RAS (unida a GDP), activándola (transforma GDP en GTP). La RAS activa transforma RAF inactiva en activa, y esta a su vez activa MEC. La MEC activa la MAP kinasa, que viaja al núcleo y estimula factores de transcripción que estimulan la expresión de genes que controlan el ciclo celular, como los oncogenes. Las mutaciones en proteínas de la vía RAS pueden provocar una estimulación continua de la vía y, con ello, de la división celular por la producción constante de factores de transcripción de oncogenes.

Otros Factores que Contribuyen a la Formación de Tumores

Procesos que Controlan la Velocidad de Aparición de Mutaciones

La frecuencia de aparición de errores y la eficacia de la corrección de los mismos son factores clave en el desarrollo del cáncer.

1. Genes de Reparación de ADN

Los defectos en los genes que codifican componentes del sistema de reparación del ADN se asocian a tumores, así como los reordenamientos cromosómicos por cortes no reparados. Un ejemplo es la Xerodermia pigmentosa, una alteración del sistema de reparación por escisión de nucleótidos causada por mutágenos.

2. Genes que Regulan la Telomerasa

La telomerasa se encarga de la replicación de los telómeros (extremos de los cromosomas) en células germinales (no somáticas, lo que limita el número de divisiones por destrucción de los cromosomas), ya que se acortan debido al posicionamiento del cebador, impidiendo que la ADN polimerasa pueda replicar los extremos. Si muta el gen regulador de la telomerasa, esta puede replicar los extremos de las células somáticas, que podrán dividirse un número ilimitado de veces.

3. Genes que Promueven la Vascularización (Angiogénesis)

Las células mutadas con mayor tasa de replicación necesitan más aporte de O₂ y nutrientes (mayor vascularización). La masa de células cancerígenas desplaza a las células sanas y afecta a su funcionalidad, robando el aporte de nutrientes. En las células tumorales, los genes que producen factores de crecimiento de vasos sanguíneos están sobreexpresados, mientras que los inhibidores están poco expresados.

4. Genes que Promueven la Diseminación de Tumores (Metástasis)

Estos genes codifican componentes de la matriz extracelular y el citoesqueleto. Si mutan, se altera la estructura celular y se facilita la diseminación. Un ejemplo es la mutación del gen palladin, que contribuye a la metástasis de tumores pancreáticos.

5. MicroRNA

El microRNA es un tipo de ARN que participa en el silenciamiento de genes que no deben expresarse, degradando el ARNm o inhibiendo la traducción. Si disminuye el microRNA, aumenta la expresión de genes que deberían estar silenciados y podrían generar tumores.

6. Cambios en la Estructura de los Cromosomas

Estos cambios corresponden a reordenamientos cromosómicos durante la replicación, que pueden afectar a genes supresores de tumores o activar oncogenes. Algunos ejemplos son:

• Translocaciones: El intercambio de material genético entre cromosomas, como la translocación entre el cromosoma 9 y el 22, se asocia a la leucemia mieloide crónica.
• Deleciones: Pérdida de un fragmento de cromosoma.
• Inversiones: Un fragmento de cromosoma gira 180º dentro del mismo, generando gametos inviables.
• Duplicaciones: Un fragmento se duplica dentro del cromosoma.

7. Cambios en el Número de Cromosomas

Se producen durante la replicación y posterior división celular (mitosis o meiosis), cuando el material genético no se reparte por igual entre las células hijas. Se producen aneuploidías y poliploidías, donde se ganan o pierden genes, cuya expresión puede provocar el aumento de la tasa de replicación celular y la aparición de cáncer.

8. Virus

Ciertos virus pueden activar los protooncogenes. Lo incorporan a su genoma viral por recombinación, donde puede mutar a oncogén (más probable que de forma normal) y vuelve a ser insertado en la célula. Los oncogenes producirán un factor estimulador celular hiperactivo que acelera la tasa de división, aumentando la probabilidad de mutaciones.

9. Cambios en la Metilación del ADN

La metilación del ADN es un proceso reversible. La hipermetilación silencia genes supresores de tumores (mutación en un alelo), mientras que la hipometilación causa inestabilidad cromosómica.

10. Factores Ambientales

Las mutaciones inducidas por agentes externos, como el tabaquismo, productos químicos y radiaciones, explican las diferencias en la incidencia de tumores en diferentes lugares.

Biotecnología

La biotecnología es la utilización de procesos biológicos, especialmente la genética molecular y la tecnología del ADN recombinante, para diagnosticar y tratar patologías, y generar fármacos. Estas técnicas permiten localizar, aislar, analizar, alterar y recombinar secuencias de ADN.

Tecnología del ADN Recombinante

Esta tecnología se basa en la combinación de fragmentos de ADN de diferentes orígenes para generar nuevos. Los procedimientos básicos son:

1. Mediante enzimas denominadas endonucleasas de restricción (específicas), se cortan fragmentos de ADN portados por vectores (pequeños fragmentos de ADN).
2. Estos fragmentos poseen extremos complementarios (misma endonucleasa, misma secuencia de restricción) y se aparean espontáneamente por complementariedad de bases (puentes de hidrógeno). Luego, la ADN ligasa une los nucleótidos por enlaces fosfodiéster.
3. El nuevo fragmento deseado, formado por el vector + los fragmentos de ADN unidos, se denomina ADN recombinante y se introduce en una célula huésped.
4. Esta célula se replica generando nuevas células que contienen el ADN recombinante en su genotipo.
5. Estas células pueden purificarse para el análisis del nuevo ADN.

Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción cortan (el esqueleto azúcar-fosfato) fragmentos de doble hélice de ADN en sitios específicos o sitios de restricción (un par de bases concreto), dado que reconocen una secuencia de nucleótidos o secuencia de reconocimiento (específica de la endonucleasa, formada por entre 4 y 8 pb, suelen ser palíndromos, se leen igual en ambos sentidos). Las endonucleasas de restricción se aislan de bacterias, que las utilizan para prevenir infecciones víricas destruyendo el material genético.

Clasificación

Las enzimas de restricción se clasifican según el organismo en el que se descubrieron, con una secuencia alfanumérica variable. Se han aislado tres tipos:

• Las enzimas de tipo I y III cortan el ADN en un punto fuera de su secuencia de reconocimiento.
• Las de tipo II cortan en un punto dentro de su secuencia de reconocimiento.

Características del Corte

Según la endonucleasa, tras el corte de la doble cadena se puede formar:

• Extremos cohesivos (corte escalonado entre ambas cadenas resultante del ancho de la secuencia de reconocimiento). Se aparean de forma espontánea por complementariedad de bases (puentes de hidrógeno) aquellos cortados por la misma endonucleasa (misma secuencia de reconocimiento). Luego, la ADN ligasa une los nucleótidos por enlaces fosfodiéster covalentes.
• Extremos romos (corte en ambas cadenas de la hélice a igual altura). No se aparean de forma espontánea, no hay complementariedad de bases. Es necesaria la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal, que añade nucleótidos a una de las cadenas para formar un extremo cohesivo.

Técnicas de Manipulación e Identificación de ADN y ARN

1. Purificación de Ácidos Nucleicos

Fuentes

Se obtienen a partir de muestras biológicas que contengan células nucleadas, ya que contienen el material genético. Ejemplos: células epiteliales de la mucosa bucal, músculo, semen, folículo piloso. Se usan tarjetas FTA, donde se deposita una gota de sangre.

Procedimiento para ADN Celular

1. Fragmentación del tejido para obtener células libres.
2. Lisis celular (mecánica, enzimática o química).
3. Separación de los ácidos nucleicos (ARN y ADN) de los restos celulares (centrifugación, filtración, enzimas).
4. Purificación del ADN (cromatografía, precipitación, productos químicos).

Extracción de ADN de Plásmidos

Se realiza mediante lisis alcalina.

1. Centrifugación en un medio selectivo como Ficoll.
2. Resuspender en una solución amortiguadora de pH y EDTA (quelante de iones Mg²⁺, inhibe nucleasas).
3. Lisis y desnaturalización alcalina (SDS disuelve lípidos de membrana y desnaturaliza proteínas, NaOH desnaturaliza proteínas y ADN, separando el ADN cromosómico del plasmídico).
4. Neutralización con acetato de amonio (precipitación de proteínas y ADN cromosómico, centrifugación para obtener el ADN plasmídico).

2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Desarrollada en 1983 por Kary Mullis, la PCR permite amplificar fragmentos de ADN específicos (marcados por primers, de doble cadena) imitando la replicación celular in vitro a partir de pequeñas muestras previamente aisladas o purificadas.

Características

• Es una reacción en cadena: tras n ciclos se obtienen 2ⁿ copias.
• Muy sensible: permite seleccionar fragmentos de ADN muy pequeños.
• Uso de termocicladores automáticos.
• Replicación catalizada por una ADN polimerasa (Taq polimerasa obtenida de la bacteria Thermus aquaticus, ya que es estable a las altas temperaturas de la desnaturalización).

Requisitos Fundamentales

1. Partir de un molde de ADN monocatenario (obtenido en la fase de desnaturalización a partir de la doble cadena) previamente purificado, del que se obtienen las copias.
2. Un cebador o primer (fragmento de ARN, en la replicación sintetizado por la ADN polimerasa α o primasa) específico (a mayor tamaño, mayor especificidad) del fragmento que se desea amplificar (conociendo los genes, se elige el cebador). Se une por complementariedad de bases a la cadena en la fase de hibridación y establece un grupo OH libre en el extremo 3′ para comenzar la adhesión de nucleótidos (fase de elongación).

Ventajas

• Rápida y fácil.
• Muy sensible (se puede partir de cantidades muy pequeñas de ADN y de origen variado).

Limitaciones

• La lejía destruye el ADN.
• Errores de la Taq polimerasa: A diferencia de la ADN polimerasa, esta no tiene mecanismo de corrección, por lo que habrá fragmentos con errores. Hay que tener controles positivos y negativos, así como usar fragmentos cortos de ADN para limitar los errores en la amplificación.
• Especificidad: Solo se pueden amplificar fragmentos de ADN (elección del cebador según los genes a amplificar), no se puede amplificar todo el genoma.
• Contaminación (por parte del investigador).
• Tamaño de los fragmentos: No es tan sensible como para trabajar con fragmentos de menos de 1500-2000 pb. Para ello se usa la clonación basada en células.

Fases

Se repiten cada pocos minutos para formar nuevas cadenas. Las temperaturas varían en cada fase gracias al termociclador.

1. Desnaturalización (90-100 °C): Rotura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas de la hélice, que se separan obteniendo cadenas de ADN monocatenario.
2. Hibridación con el cebador o primer (annealing) a temperatura variable de 30-65 °C (a mayor temperatura, mayor especificidad). Selecciona el fragmento que se desea amplificar y establece un grupo OH libre en el extremo 3′, donde la polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Cada cebador tiene una secuencia complementaria distinta, de ahí la importancia de su elección según el fragmento que se quiera amplificar.
3. Extensión o elongación (72 °C aproximadamente): La Taq polimerasa sintetiza las nuevas cadenas de ADN añadiendo nucleótidos a partir del cebador.

Tipos de PCR

1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Empleo de cebadores pequeños (más inespecíficos cuanto menor tamaño, menos pb a complementar) y con baja temperatura en la fase de hibridación (más inespecífica cuanto menor temperatura). Al utilizar cebadores poco específicos, se unen a muchos fragmentos, se amplificarán muchas cadenas (representa más al genoma o conjunto de genes), obteniendo muchas bandas. Se utiliza para el análisis de mutaciones o genotoxicidad, incluso de solo un nucleótido (SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms), comparando la unión de cebadores entre una persona sana y una mutada, en la cual no se une el cebador (no hay bases complementarias) y no se amplifica el fragmento.

• Ventajas: Fácil diseño de los cebadores por su pequeño tamaño.
• Limitaciones: Necesarias condiciones estables y reproducibles en las fases, dada la variación de especificidad según la temperatura.

2. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Se realiza una PCR normal, tras la que se aplican diferentes endonucleasas de restricción (específicas de una secuencia de reconocimiento) a los productos para diferenciar alelos (presentaciones de un mismo gen) que difieren incluso en un nucleótido (SNPs), pudiendo saber dónde está la variación comparando si la misma endonucleasa (misma secuencia de reconocimiento) corta o no. Si no corta ambos fragmentos, habrá alelos diferentes.

3. ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

Es la más específica. Se deben diseñar cebadores muy específicos para dos alelos de un mismo gen. Permite diferenciar alelos que difieren incluso en un nucleótido (SNPs). Utiliza la especificidad de los cebadores en la fase de hibridación (se une por complementariedad de bases a la cadena y establece un grupo OH libre en el extremo 3′, donde actúa la polimerasa) para aislar un nucleótido (SNP), colocando cebadores delante y detrás (solo se amplifica dicho nucleótido entre el extremo 3′ de ambos cebadores). Contra mayor tamaño del cebador, más específico. Esta hibridación se realiza con ambos alelos de un mismo gen con cebadores específicos para cada uno en dos PCR diferentes, una para cada uno. Para un individuo homocigoto (alelos iguales) se obtiene amplificación solo en una de las PCR (en la otra no hibrida el cebador específico para el otro alelo), mientras que en heterocigotos se amplifican ambos alelos (hibridan los cebadores en ambas PCR).

Haremos que un primer hibride con adenina y que otro hibride con guanina, por lo tanto haremos 2 PCR.

En una tendremos el A más el R y en otro el C y el R, así que en cada PCR amplifico cada uno de esos genes.

Para un homocigoto 1-1 solo habrá amplificación A+R, no habrá en B+R. Uno 2-2 no tendrá A+R y sí B+R. Un heterocigoto (1-2) tendrá ambos, A+R y B+R.

Hace posible distinguir entre alelos que difieren tan sólo en un único nucleótido (SNPs).

Los cebadores se preparan con sus nucleótidos en el extremo 3′ diseñados para formar pares de bases con el nucleótido variable que distingue los dos alelos.

Requiere condiciones experimentales adecuadas para distinguir ambos alelos.

4. PCR Anidada o con Cebador Anidado

Se utiliza para incrementar la especificidad. Se diluyen los productos de una reacción de amplificación inicial y se emplean como fuente de ADN de inicio para una segunda reacción en la que se usa un grupo de cebadores diferentes que corresponden a secuencias localizadas próximas pero internas en la primera reacción.

Vamos a hacer 2 PCR consecutivas, el producto de la primera nos sirve de muestra a partir de la cual haremos la segunda.

El diseño de los primers: tendremos primers que amplifican un fragmento de ADN. Este producto se hace pasar por una segunda, nos amplifican, dentro de ese fragmento de la primera, un fragmento más pequeño.

De esta forma aumentamos la especificidad de la PCR, no ponemos esta segunda pareja en contacto con todo el genoma, sino que solo amplificará dentro del fragmento más grande.

Cuando tenemos muestras con muy poca cantidad de ADN inicial y con una PCR es difícil su visualización, en estos casos usamos este tipo de PCR.

5. PCR-TI (PCR de Transcriptasa Inversa)

PCR que parte de mRNA y la transcriptasa inversa produce cDNA (ADN complementario).

Nos indica que en lugar de partir de RNA partimos de mRNA, que por retrotranscripción hacemos DNA complementario al que le aplicamos una PCR normal. Ese ADN está en proceso de expresión. Si queremos saber si en las personas están expresando el ADN, tendremos que partir del mRNA. Principalmente se utiliza para el análisis de expresión génica.

6. PCR en Tiempo Real

PCR cuantitativa en la que se mide de forma continua la cantidad de secuencias amplificadas. Los equipos de amplificación llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia.

Vamos obteniendo de forma continua información del proceso.

Necesitaremos equipos que detecten la fluorescencia de aquello que van replicando ciclo a ciclo.

Ventajas de la PCR en Tiempo Real

• Mayor sensibilidad. Puede detectar menores cantidades de ADN al principio.
• Resultados reproducibles y mucho más precisos.

Lo de abajo es el número de ciclos (de 0 a 40). La fluorescencia va detectando a tiempo real. Al principio da una fluorescencia baja, luego no varía, cuando aumentan los ciclos se empiezan a visualizar los productos, y se ve la subida exponencial de la fluorescencia.

Hay un ciclo, el Ct, que va a ser el resultado de la PCR a tiempo real. Es el ciclo en el que aumenta exponencialmente la fluorescencia, después seguirá aumentando. En una PCR normal solo veríamos la parte del final.

Lo importante es el ciclo a partir de donde se empieza a aumentar la fluorescencia, en todas las muestras nos dará el mismo resultado, el mismo ciclo a partir del cual aumenta exponencialmente la fluorescencia de la muestra. Ct.

Diferentes puntos finales en replicados como resultado de PCR convencional.

Alta precisión durante la fase exponencial (resultado de RT-PCR).

El parámetro fundamental, a partir del cual se realizan los cálculos analíticos y la obtención de resultados en la RT-PCR es el CICLO UMBRAL (Threshold Cycle ó Ct) que es el ciclo a partir del cual la fluorescencia es estadísticamente significativa por encima del ruido de fondo (background).

En una muestra con poca cantidad de DNA, el Ct será mayor que si hay mucho ADN inicial. Normal, si hay mucho ADN se replica antes, cuanto menos hay más tarda. Por tanto nos indica cuánta cantidad de ADN inicial hay.

Propiedades del Ciclo Umbral

• Separa los datos del ruido de fondo (background) (suele establecerse como 10 veces el ruido de fondo).
• Determina el ciclo inicial de amplificación.
• Es inversamente proporcional al número de copias inicial del DNA de la muestra. Cuanto más DNA el Ct es más pequeño y viceversa.

Se emplean diferentes tipos de fluoróforos (sustancias que hacen que aparezca la fluorescencia).

a) NO ESPECÍFICOS

Detectan todos los DNA de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación (producto específico, producto inespecífico e incluso dímeros de primers). Se unirán a cualquier fragmento de ADN de doble cadena.

Consiste en añadir un agente intercalante de la doble cadena que es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a moléculas de DNA de doble cadena y se excita a una longitud de onda específica para cada fluoróforo. Ej: SYBR Green.

Lo que emite fluorescencia, al no ser específico, puede ser lo que buscamos o no. Solo se usan en casos muy contados en los que hay muchísima especificidad de la PCR.

b) ESPECÍFICOS

Se basan en la utilización de quenchers y sondas marcadas con un amplio rango de fluoróforos. Además usaremos los Quencher que nos van a permitir marcar las sondas con los fluoróforos.

Los fluoróforos son moléculas que absorben energía y pasan a un estado excitado; posteriormente, al volver al estado inicial emite el exceso de energía en forma de fluorescencia.

Los quenchers son moléculas que aceptan la energía de un fluoróforo y la disipan en forma de calor o fluorescencia. Cuando un Quencher y un fluoróforo se encuentran juntos o muy próximos no se emite fluorescencia. Cuando se separan sí emite la fluorescencia. Esa separación física entre fluoróforo y Quencher es lo que utilizaremos.

3 Sondas Específicas Más Utilizadas

Sondas TaqMan

La más usada. En estas sondas se une un fluoróforo (reporter) al extremo 5′ de la sonda y un quencher al 3′. Dentro de la misma sonda tendrá reporter y Quencher. Como el Quencher capta la energía, no hay fluorescencia. Para que haya fluorescencia algo ha de cortar esta cadena, y va a ser la polimerasa.

Cuando la Taq polimerasa empieza a amplificar a partir del primer unido al DNA diana, desplaza el extremo 5′ de la sonda que es degradado por la actividad exonucleasa 5′  3′ de la Taq, se libera el fluoróforo al medio separándolo del quencher, lo que ocasiona un aumento de la fluorescencia detectada.

Después de que se unan las sondas, también se unen los primers, cuando empiezan a amplificar la cadena, la Taq polimerasa quita el floróforo por la actividad exonucleasa y se produce la fluorescencia.

Sondas Molecular Beacon

Consisten en una estructura en horquilla en la cual el bucle es DNA monocatenario complementario del amplicón. El brazo de la horquilla tiene una longitud aproximada de 6 bases, está formada por C y G y es la encargada de mantener la estructura de la horquilla. El fluoróforo está unido a uno de los extremos del brazo y el quencher al otro extremo.

Tenemos una estructura secundaria, la parte del bucle es lo que tiene que hibridar con el ADN. Los 2 extremos de la horquilla van a ser comunes para todos los beacon, van a ser bases complementarias de C-G. Así hacemos que se aproximen el reporter y el Quecher, y así este no produce fluorescencia.

Durante la PCR, la sonda se une a la secuencia específica del DNA diana ya que el heterodúplex sonda-diana es termodinámicamente más estable que la estructura de horquilla de la sonda.

En la parte de hibridación solo hibrida lo del bucle y se quedan los brazos de C y G colgando. Como el reporter y Quencher ya no están tan juntos emite fluorescencia. Nos permite hacer sondas más grandes.

Sondas Scorpion

Tienen una estructura de horquilla al igual que las sondas Molecular Beacon, pero la horquilla está unida al extremo 5′ de un primer específico por medio de un «bloqueante de la PCR».

La unión de la sonda a la secuencia diana es intramolecular. Durante la PCR, después de la extensión del primer, la secuencia específica de la sonda se une a la región complementaria dentro de la misma hebra de DNA. La hibridación abre la estructura de horquilla y se observa un incremento de la fluorescencia.

Principales Aplicaciones

• Cuantificación (n° de moléculas iniciales de DNA, cuantificación de expresión génica…).
• Discriminación alélica (empleo de sondas marcadas con fluoróforos diferentes para cada alelo que se necesite identificar).

3. Hibridación y Marcaje de Sondas

Hibridación

El ADN tiene la capacidad de, una vez desnaturalizado, volver a unirse o formar pares de bases entre cadenas complementarias.

Esta capacidad permite la formación de moléculas híbridas cuando se mezclan moléculas de ADN homólogas desnaturalizadas provenientes de dos fuentes diferentes y se mantienen condiciones apropiadas de fuerza iónica y temperatura.

El proceso de apareamiento de bases entre monocadenas de polinucleótidos complementarios provenientes de fuentes distintas se denomina hibridación.

Muchas técnicas dependen de la especificidad de la hibridación entre dos moléculas de ADN con secuencias complementarias.

Ejemplos: primers y sondas en la técnica PCR, y sondas para la detección de secuencias en técnicas de clonación de ADN basada en células.

Este método permite identificar las secuencias específicas dentro de compuestos complejos

de ácidos nucleicos.

DISEÑO DE PRIMERS

PRIMER (o cebador): punto de anclaje de la DNA polimerasa y promotor del inicio de la reacción de replicación del DNA en puntos deseados de una muestra.

Propiedades de un primer:

1) Debe ser específico de la región que se quiere replicar.

2) Debe unirse con suficiente energía para soportar las condiciones del experimento.

3) No debe permitir la formación de estructuras que dificulten la reacción.

La obtención de un producto final como resultado de la reacción en cadena de la polimerasa depende en buena medida del diseño de los primers.

Específicos para secuencias que flanquean a la secuencia blanco (orientación opuesta).

Tamaño. Influye en especificidad, ta de fusión y tiempo necesario para la hibridación. Inversamente proporcional a eficacia hibridación.

Composición de bases: contenido de GC de 40 a 60% con una distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.

Temperatura de fusión (Tm) de los 2 cebadores no debe variar más de 5°C. Estima la estabilidad de la unión del primer al DNA.

Tm = 2°C (A + T) + 4°C (G + C)

Secuencias terminales 3′ no deben ser complementarias a ninguna región del otro cebador en la misma reacción.

Se aconseja que el extremo terminal 3′ acabe en C ó G.

Evitar secuencias invertidas o autocomplementarias > de 3 pb.

GENBANK (LOCALIZAR GEN): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

PRIMER3 (DISEÑO DE PRIMERS): http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

BLAST (CHEQUEO DE PRIMERS CON SECUENCIAS GENBANK)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Nucleot ides&PROGRAM=blastn&BLAST PROGRAMS=mega Blast&PAGE TYPE=BlastSearch&SHOW DEFAULTS

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MARCAJE DE SONDAS

La sonda con una secuencia conocida de nucleótidos puede ser un fragmento purificado o una molécula de DNA sintetizada por métodos químicos.

La sonda debe estar marcada para localizarla de inmediato una vez que encuentre la secuencia buscada.

Hay dos métodos principales que permiten marcar el DNA:

Agregar una señal al extremo de una molécula de DNA completa (normalmente en el grupo fosfato en 5′).

Marcar por incorporación mediante PCR de un precursor marcado (nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o átomos radiactivos).

4. Electroforesis en geles:

ELECTROFORESIS EN GELES

La electroforesis es una técnica bioquímica estándar para la separación de moléculas según su tamaño y su carga eléctrica.

Las moléculas lineales de DNA se separan cuando se someten a un campo eléctrico a través de una matriz tipo gel, que es un material poroso inerte.

Las moléculas de DNA tienen carga negativa y cuando se someten a un campo eléctrico migran a través del gel hacia el polo positivo.

Se utilizan dos tipos alternativos de matrices de gel: la poliacrilamida (mayor capacidad de resolución pero sólo sirve para la separación de fragmentos de pocos cientos de bases) y la agarosa (más común).

GELES DE AGAROSA

La agarosa es un polisacárido que se funde en una solución buffer y se deja solidificar en un molde.

Las moléculas de DNA son flexibles y ocupan un volumen efectivo.

Cuando se somete a una corriente eléctrica, los poros en la matriz tipo gel tamizan las moléculas de DNA de acuerdo con este volumen.

Las moléculas grandes migran a través del gel con mayor lentitud porque tienen un volumen efectivo mayor que las pequeñas y tienen mayor dificultad para atravesar los intesticios del gel.

La visualización del resultado de la electroforesis en gel de agarosa requiere que el gel haya sido teñido previamente.

Las tinciones más frecuentes son:

a) bromuro de etidio: agente intercalante del DNA que produce bandas de color anaranjado brillante (fluorescencia) cuando se expone el gel a luz UV.

b) SYBR Safe: agente intercalante del DNA, mayor seguridad de uso que bromuro de etidio.

A veces se tiñen directamente los fragmentos de DNA mediante adición de marcación radiactiva o sustancia química antes de colocarlo en el gel.

ELECTROFORESIS EN GELES

La electroforesis también se usa para la separación de moléculas de RNA y proteínas.

1) El RNA tiene una carga negativa uniforme pero las moléculas de RNA suelen ser monocatenarias y poseen estructuras secundaria y terciaria extensas que influyen en su movilidad electroforética.

Las moléculas de RNA se pueden tratar con reactivos, como el glioxal, que reacciona con el RNA para impedir la formación de los pares de bases y así migrarán con una movilidad aproximadamente proporcional a su peso molecular.

2) Las proteínas no tienen carga negativa ni estructura secundaria uniformes. En función de los aminoácidos van a tener una carga u otra. Van a poder formar estructuras secundarias.

Si la proteína se expone a un detergente iónico fuerte como el dodecil sulfato de sodio (SDS). Los iones de SDS cubren la cadena polipeptídica y le otorgan una carga negativa uniforme. Así solucionamos el 1º problema.

El mercaptoetanol (agente reductor) reduce las uniones disulfuro entre los residuos de cisteína: suelen desaparecer las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias (complejos multiméricos).

Las proteínas se pueden observar con un colorante como el azul brillante de Coomassie.

En ausencia de SDS, se puede emplear la electroforesis para separar proteínas en función de otras propiedades como el punto isoeléctrico (pH en el que una proteína no exhibe carga neta).

5. Transferencia a membranas:

HIBRIDACIÓN SOUTHERN BLOT (si transferimos ADN)

Sirve para localizar fragmentos de ácidos nucleicos específicos después de separarlos mediante electroforesis. Requerirá un primer paso que es la electroforesis del DNA que estamos usando digerido previamente con endonucleasas de transcripción.

El DNA blanco se digiere con una o más endonucleasas de restricción, lo que genera fragmentos que tienen de varios cientos a varios miles de pares de bases de longitud.

Los fragmentos de restricción se fraccionan según su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa, se desnaturalizan (solución alcalina) y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nylon para hibridación (carga positiva).

Tras haber desnaturalizado el ADN. La característica que tiene que tener es que este cargada positivamente.

Los fragmentos de DNA se fijan en la membrana en posiciones comparables con los sitios donde migraron a través del gel durante la electroforesis.

Se incuba el DNA unido a la membrana con una sonda de DNA que tiene una secuencia complementaria a la del gen buscado, en condiciones de hibridación específica (concentración salina y temperatura).

Se lava la membrana para eliminar la sonda que no se ha unido.

Para detectar el sitio sobre la región de transferencia donde la sonda realiza la hibridación se puede emplear diferentes procedimientos: radiactivos o químicos.

Aplicación: identificación del tamaño de un fragmento específico que contiene el gen buscado.

HIBRIDACIÓN NORTHERN BLOT (con ARN)

Transferencia de RNA de un gel a un soporte sólido.

Como las moléculas de RNA son relativamente cortas (normalmente

Protocolo similar a Southern blot.

Nos permite comparar que en diferentes tejidos extraigo el ARNmensajero y veo si hay una expresión diferencial en otros tejidos por comparación entre ellos. Nos dice en que tejidos se expresa más o menos, a la hora de ver patrones de expresión.

APLICACIÓN: La hibridación de una sonda puede revelar el tamaño de una molécula de mRNA particular, su abundancia relativa o los tejidos en los que se transcribe (PATRONES DE EXPRESIÓN DE GENES ESPECÍFICOS).

INMUNOTRANSFERENCIA WESTERN (con proteínas)

Transferencia de la proteína de un gel a una membrana.

Las proteínas separadas por electroforesis se transfieren y unen a un filtro, que luego se incuba en una solución con un anticuerpo contra la proteína purificada en cuestión.

Se incuba con el anticuerpo específico de esa proteína, y para visualizar si se ha unido o no se usa una enzima cromogénica.

Se utiliza una enzima cromogénica para detectar el anticuerpo unido al filtro.

APLICACIÓN: determinar el tamaño de una proteína particular y supatrón de expresión.

6. Secuenciación de ácidos nucleicos:

SECUENCIACIÓN DEL DNA

El principio básico de la secuenciación es la separación de los grupos de moléculas de DNA de acuerdo con su tamaño.

Secuenciar: conocer el orden de nucleótidos.

El método de secuenciación más usado: método de terminación de la cadena o método didesoxi (sanger).

Este método se basa en la replicación.

Tenemos una secuencia molde y queremos obtener la complementaria.

El fragmento que se va a secuenciar se utiliza como molde para sintetizar una serie de nuevas moléculas de DNA.

Se utilizan unos nucleótidos especiales: didesoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTP) que son idénticos a los dNTP pero carecen del grupo 3′-OH. En lugar de añadir los dNTP añadimos ddNTP. La diferencia entre ambos es el extremo 3’, en los ddNTP les falta el grupo OH en el extremo 3’, como consecuencia no se podrá seguir con el método.

En el transcurso de la síntesis de DNA se incorporan los ddNTP y una vez que se han incorporado no pueden agregarse más nucleótidos.

Las muestras se dividen en 4 porciones que se colocan en tubos de reacción diferentes al que se le agrega: primer, dNTPs, un ddNTP diferente a cada tubo, DNA polimerasa.

La incorporación de ddNTP ocurre al azar en diferentes posiciones en las distintas copias: se genera un conjunto de cadenas de DNA de diferentes longitudes que se visualizan en geles de poliacrilamida.

Dibujar las bandas que deberían aparecer en el gel de poliacrilamida a partir de las cuatro reacciones de secuenciación del siguiente fragmento de DNA:

Los secuenciadotes automáticos parten de los mismos principios de la secuenciación de terminación de la cadena pero utilizan ddNTP marcados fluorescentemente (colores diferentes para cada ddNTP) y escáneres con láser.

Las cuatro reacciones de secuenciación pueden realizarse en el mismo tubo y colocarse en la misma calle para la electroforesis (tubos capilares).

Los fragmentos pasan por el láser, sus marcas fluorescentes se activan y la fluorescencia se detecta en un lector óptico.

PIROSECUENCIACIÓN

Se basa en la secuenciación por síntesis junto con una reacción quimioluminiscente.

Tienen lugar cuatro reacciones enzimáticas en un tubo en el que se monitoriza la síntesis de la cadena complementaria de DNA.

Enzimas:

– DNA polimerasa

– ATP sulfurilasa

-luciferasa

-apirasa

Se produce luz, de forma proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporados.

La generación de luz se detecta en forma de pico y se graba gracias a un sistema de detección.

Reacciones enzimáticas:

1) DNA polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a la cadena de DNA molde. Si se incorporan se libera pirofosfato inorgánico (PPi) proporcionalmente a cantidad de dNTP.

2) ATP- sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de APS (adenosina-5′-fosfosulfato).

3) El ATP permite conversión de luciferina en oxiluciferina por luciferasa y genera luz visible proporcional a la cantidad de ATP.

4) Apirasa degrada dNPS no incorporados.

APLICACIONES PRINCIPALES: Secuenciación de fragmentos cortos de DNA, detección de SNPs y análisis de metilación.

SECUENCIACIÓN DEL DNA

Programa informático para comparar secuencias: alineamiento de secuencias e identificación de polimorfismos/snps: BIOEDIT

¿Cómo interpretaríais este resultado de secuenciación de un fragmento de gen específico amplificado por PCR?

En la posición 201 presenta 2 picos. Se ha secuenciado por el método didesoxi, una lectura continua de picos, pero no nos indica proporciones. Lo que le pasa es que es heterocigoto para esa posición, su padre tenia una C y su madre una T

VECTORES

MÉTODO DE CLONACIÓN DE DNA BASADO EN CÉLULAS

Clonación de DNA: capacidad de formar moléculas de DNA recombinantes y mantenerlas en las células.

El proceso típico es el empleo de un VECTOR que aporta la información necesaria para propagar el DNA clonado hacia la célula (hospedador) y un INSERTO de DNA que se introduce dentro del vector y presenta el DNA en cuestión.

Base del procedimiento: crear moléculas recombinantes mediante el empleo de enzimas de restricción y otras enzimas que unen entre sí los fragmentos de DNA seccionados.

APLICACIONES:

Purificar un inserto determinado de DNA y aislarlo del resto

Amplificación de un fragmento de DNA para producirlo en grandes cantidades

VECTORES

Los vectores de DNA típicos tienen tres características:

1) Un origen de replicación que les permita replicarse en forma independiente del cromosoma del hospedador.

2) Algún tipo de marcador seleccionable que les permite identificar con facilidad las células que contienen el vector (junto con cualquier fragmento de DNA).

3) Sitios independientes para la unión de una enzima de restricción o varias. Permite la inserción de los fragmentos de DNA en un punto específico dentro de un vector íntegro. Como se conoce el genoma de los vectores sabemos donde de va a producir el inserto.

PLÁSMIDOS

Plásmidos = moléculas DNA circular (naturalmente en bacterias).

Se corta el DNA y el plásmido con la misma enzima de restricción y se mezclan.

La DNA ligasa sella las uniones en el esqueleto de azúcares fosfatados: plásmido recombinante.

El plásmido recombinante se introduce en células bacterianas mediante TRANSFORMACIÓN: capacidad de las células bacterianas de captar el DNA del ambiente externo, de forma natural o previo tratamiento químico o físico.

Los plásmidos se replican.

Las células que portan plásmidos recombinantes pueden detectarse mediante el empleo de marcadores

de selección:

Gen /acZ. Cuando se inserta DNA extraño en el sitio de restricción se altera el gen y la p-galactosidasa no se produce. Se añade X-gal en el medio de cultivo: -galactosidasa lo degrada y produce una sustancia de color azul.

¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO RECOMBINANTE!!!

Gen que confiere resistencia a un antibiótico (ampicilina). Se añade al medio de cultivo el antibiótico.

¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO!!

Las que no tiene el inserto tiene -galactosidasa…

OTROS VECTORES

Bacteriófagos = virus que infecta a bacterias.

Cósmidos = plásmidos empaquetados dentro de cápsides proteicas virales vacías.

Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son vectores inicialmente construidos a partir del plásmido F (plásmido especial que controla el apareamiento y la transferencia de material genético en algunas bacterias).

VECTORES DE EXPRESIÓN

Si el objetivo de la clonación génica es también producir la proteína que codifica se debe incluir el gen en un vector de expresión.

Contiene secuencias necesarias para la transcripción y la traducción en las células bacterianas.

OTROS VECTORES DE CLONACIÓN

Existen vectores de clonación que permiten la inserción de genes en células eucariontes.

Sirven para incluir modificaciones esenciales que deben sufrir las proteínas tras su traducción para ser funcionales.

YAC= cromosoma artificial de levadura. Es una molécula de DNA con un origen de replicación de levadura, un par de telómeros y un centrómero.

Los YAC son estables, se replican y segregan de la misma forma que los cromosomas de la levadura.

Pueden transportar fragmentos de DNA de 600 Kb.

GENOTECA

GENOTECA = colección de clones que contiene todos los fragmentos de DNA provenientes de una fuente.

1) GENOTECA GENÓMICA:cortarel DNA genómico con enzimas de restricción durante un período limitado (digestión parcial) para conseguir cortes en algunos sitios de restricción en cada molécula de DNA.

Se producen un conjunto de fragmentos superpuestos.

Número de clones elevado para contener una representación de todo el genoma (depende del vector).

2) GENOTECA DE cDNA:apartir de secuencias de DNA que se transcriben en mRNA. Es una genoteca de ADN complementario.

Ventajas:

Enriquecida con fragmentos de genes transcritos en forma activa.

Los intrones no interrumpen las secuencias clonadas (las bacterias no pueden eliminarlos).

Desventaja: contiene sólo secuencias que están presentes en el mRNA maduro y que se expresan en el tejido a partir del cual se aisló el RNA.

Requiere de un primer paso en el cual se separa el mRNA del resto.

COLONY BLOT

Las células se diluyen y se siembran en placa de manera que cada bacteria crezca en una colonia separada.

Cada placa o colonia bacteriana contiene un fragmento de DNA clonado que debe evaluarse para encontrar el gen de interés.

Las placas o colonias deben transferirse a membranas

La búsqueda en colonias se realiza mediante el empleo de sondas complementarias.

PROCESO DE OBTENCIÓN DE FÁRMACOS DE ORIGEN BIOTECNOLÓGICO

La mayoría de los fármacos tradicionales son compuestos orgánicos que contienenungrupo limitado de grupos funcionales.

Los fármacos obtenidos mediante procesos biotecnológicos son, sobre todo, las proteínas terapéuticas que pueden contener cientos de aminoácidos.

A los pacientes no les importa si el fármaco ha sido obtenido por medios químicos o biotecnológicos: SÓLO QUE FUNCIONE.

Los procesos de producción biotecnológicos son más complejos que los procesos tradicionales de producción de fármacos.

La mayoría de los fármacos elaborados mediante métodos biotecnológicos son proteínas que son altamente sensibles a cambios en su entorno.

Su estructura depende de diversas interacciones, a menudo débiles, entre los aminoácidos.

Estas interacciones están óptimamente coordinadas sólo en un margen estrecho de condiciones ambientales que corresponden precisamente a aquellas que se encuentran en el organismo del cual derivan las proteínas.

Incluso cambios relativamente pequeños en la temperatura, concentración de sales o pH de la solución pueden dañar la estructura y por tanto neutralizar la función de la proteína.

La mayoría de estas moléculas actúan como mensajeros químicos en el cuerpo.

Las células diana que reciben y traducen las señales tienen receptores especiales en su superficie en las cuales el correspondiente mensajero químico encaja perfectamente.

Si la estructura tridimensional del mensajero químico se altera ligeramente, la molécula no será reconocida por su receptor y será inactiva.

La situación es similar con otro grupo de proteínas terapéuticas: los anticuerpos.

En la biosíntesis natural de proteínas, en las células del cuerpo, una serie de enzimas se encargan de la correcta formación de las estructuras proteicas.

La producción de proteínas no puede realizarse mediante métodos químicos.

La mayoría de fármacos obtenidos mediante la aplicación de la biotecnología se producen en cultivos de microorganismos y células de mamíferos.

Cuando las sustancias constan de varias proteínas o sustancias que tienen que ser modificadas por adición de grupos no proteicos como cadenas de azúcares se deben emplear cultivos de células de mamífero.

Las células son organismos vivos y reaccionan incluso a pequeños cambios en su ambiente, no sólo a factores controlables como en la síntesis química convencional sino también a la solución de nutrientes y cualquier objeto o sustancia que entre en contacto con ellas.

Cada planta de producción biofarmacéutica es esencialmente única.

Los laboratorios y las empresas biotecnológicas trabajan con líneas celulares específicas que están muy estudiadas y susceptibles de estandarización.

Los investigadores biotecnológicos insertan genes estructurales y de control en las células de las líneas para producir el fármaco.

La nueva línea celular creada se trata normalmente como un secreto empresarial.

Se guardan como un banco celular que se conserva a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196°C para conservación a largo plazo).

El proceso de producción consiste en 4 pasos principales:

1) CULTIVO. Las células se transfieren del banco celular criogénico a un medio líquido con nutrientes que les permiten reproducirse.

La longitud de este paso depende del tipo de célula usada.

En condiciones favorables las células bacterianas se dividen una vez cada 20 minutos y las células de mamíferos se dividen una vez cada 24 horas.

Durante la fase de crecimiento el cultivo celular se transfiere a recipientes de cultivo de mayor tamaño progresivamente.

2) FERMENTACIÓN. El medio de cultivo contiene las sustancias necesarias para la síntesis de la proteína terapéutica deseada.

El medio de cultivo contiene alrededor de 80 constituyentes diferentes en esta etapa.

Los recipientes en los que tiene lugar la fermentación tienen capacidades de unos 10000 litros (limitaciones tecnológicas y biológicas).

3) PURIFICACIÓN.

Si las células cultivadas secretan el producto en la solución ambiente, se separan las células del medio de cultivo (centrifugación, filtración) y el producto se aisla tras varios pasos de purificación.

Si el producto permanece en el interior de lascélulas, las células se aislan, digieren y los desechos celulares se separan de la solución junto con el producto.

El rendimiento de procesos de bioproducción es generalmente menor que la síntesis química.

Tanto la purificación como el análisis de de cada lote de producto final duran varias semanas. Se requiere un nivel de pureza de 99,9 % para aprobación.

4) FORMULACIÓN.

Las proteínas sensibles se deben convertir en formas farmacéuticas estables y deben ser guardadas, transportadas y finalmente administradas en condiciones de seguridad.

A lo largo de estos pasos se debe salvaguardar la integridad estructural de la molécula para mantener su eficacia.

La naturaleza sensible de muchos fármacos de origen biotecnológico hace que se deban emplear soluciones especiales en las que el producto puede ser criogénicamente congelado y preservado.

La forma de administración de los mismos suele ser a través de soluciones inyectables (evita pH ácido de estómago y pueden atravesar la pared intestinal).

EJEMPLO DE MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE INSULINA

El primer producto génico humano manufacturado utilizando DNA recombinante y con licencia para usos terapéuticos fue la INSULINA

HUMANA. N terminal

La subunidad A tiene 21 aminoácidos y la subunidad B tiene

Se utilizaron oligonucleótidos para construir genes sintéticos de las subunidades A y B (63 y 90 nucleótidos respectivamente).

La molécula de insulina madura consiste en dos cadenas polipeptídicas (cadenas A y B) unidas por puentes disulfuro.

Cada oligonucleótido sintético se insertó en un vector en una posición adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima p-galactosidasa.

El producto es un polipéptido de fusión: secuencia aminoacídica de p-galactosidasa unida a la de una de las subunidades de la insulina.

Se purifican las proteínas de fusión de extractos bacterianos y se tratan con bromuro de cianógeno: corta la proteína de fusión produciendo p-galactosidasa y una de las subunidades de la insulina.

Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontáneamente formando una molécula de insulina intacta y activa.

MODIFICACIONES DE PROTEÍNAS

El incremento en la eficacia de las proteínas se puede conseguir con la ayuda de modificaciones específicas.

Un método para inducir modificaciones en proteínas es conocido como PEGILACIÓN.

El fármaco se envuelve en una o dos moléculas de PEG (polietilenglicol) que protegen al fármaco del sistema metabólico humano, prolongando así la actividad del mismo.

Ej: modificación del interferón-alfa-2a recombinante (fabricado a partir de E.coli) como tratamiento de hepatitis B y C.

Beneficios: el fármaco permanece activo durante más tiempo en el cuerpo, se puede reducir la dosis administrada y fluctúan menos los niveles del fármaco (efectos secundarios más tolerables).

Biofármacos

DIFERENCIAS ENTRE BIOFÁRMACOS Y FÁRMACOS DE SÍNTESIS QUÍMICA

CARACTERÍSTICAS FARMACOCINÉTICAS DE LOS BIOFÁRMACOS

Cuando la cte de eliminación es mayor a la de absorción.

VENTAJAS/DESVENTAJAS DE BIOFÁRMACOS

1) VENTAJAS: EFICACIA Y SEGURIDAD

Gracias a su estructura, las proteínas tienen una afinidad fuerte por una molécula diana específica.

Son poco frecuentes la aparición de interferencias o interacciones peligrosas con otros fármacos, e incluso los efectos secundarios.

2) DESVENTAJAS:

Por su naturaleza, presentan una biodisponibilidad oral escasa.

Es más frecuente que desencadenen reacciones inmunes.

BIOFÁRMACOS EN ESPAÑA

Hasta el día 28 de febrero de 2011 estaban comercializados en España 85 principios activos farmacológicos de origen recombinante:

104 medicamentos

313 formatos

La mayoría están calificados como medicamentos hospitalarios.

Los grupos principales de biofármacos se incluyen en los siguientes grupos:

Anticuerpos monoclonales

citocinas -enzimas

Proteínas hormonales

Vacunas biotecnológicas

1. ANTICUERPOS MONOCLONALES

Son: anticuerpos que derivan todos de un mismo linfocito B.

Tipos: murinos, quiméricos y humanos.

Diferencias: en la región variable.

El inicio de la obtención de anticuerpos monoclonales frente a una proteína diana se realizó mediante la fusión de linfocitos B procedentes del bazo de ratones inmunizados con la proteína de interés, y una célula de mieloma (célula neoplásica de la misma estirpe que los linfocitos B).

La nueva célula se denominó HIBRIDOMA con propiedades:

Capacidad de producir el anticuerpo

Inmortalidad en cultivo

El uso clínico de los primeros anticuerpos monoclonales era mayoritariamente de origen murino (ratones).

Los anticuerpos de origen murino son capaces de desencadenar respuestas de anticuerpos humanos anti-Ig murinas: pérdida de eficacia y reacción inmunitaria generalizada.

Se han desarrollado nuevos tipos de anticuerpos monoclonales: anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpos (Fab).

En un anticuerpo quimérico las regiones variables provienen de una inmunoglobulina de origen murino, mientras que las regiones constantes tienen origen humano. Ej: infliximab.

En el desarrollo de anticuerpos humanizados(human-like): regiones hipervariables del anticuerpo murino entre las regiones de entramado de un dominio variable humano, generando un dominio variable híbrido, transfiriendo una especificidad de reconocimiento determinada a una molécula completamente humana en el resto de su secuencia.

En clínica también se utilizan:

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO (Fab): moléculas completas de anticuerpo a las que se somete a determinados procesos químicos que eliminan selectivamente determinadas fracciones proteicas, dando lugar a moléculas más ligeras, menos inmunogénicas, más solubles, etc. Ej: bevacizumab.

PROTEÍNAS DE FUSIÓN: resultado de combinar partes de anticuerpos con fracciones peptídicas de determinados receptores biológicos o de sus correspondientes ligandos. Ej. abatacept.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales están indicados en cuadros de artritis reumatoide o en neoplasias.

2. CITOCINAS

Las citocinas suelen ser moléculas peptídicas ligadas a cadenas glucídicas con el fin de incrementar su estabilidad y solubilidad en el medio extracelular.

Se trata de moléculas con elevada actividad biológica pero con una duración de efectos muy breve (degradación por proteasas).

Ejercen sus funciones reguladoras mediante la unión a receptores en la superficie de las células diana y, mediante señalización celular, activan una serie de factores de transcripción para que se transcriban unos genes concretos cuyos productos son los que ejercen el efecto biológico correspondiente.

Entre las citocinas:

FACTORES ESTIMULADORES DE LA FORMACIÓN DE COLONIAS (CSF) que afectan al crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas.

EPOETINA (eritropoyetina de origen recombinante): factor estimulante de la diferenciación y maduración de los precursores de eritrocitos.

IMPORTANTE: los receptores biológicos de la eritropoyetina pueden expresarse también sobre la superficie de diversas células tumorales y existe riesgo de trombosis: se ha cuestionado su utilización en pacientes con cáncer.

INTERLEUCINA: parte esencial del sistema inmunitario (intercomunicación entre subpoblaciones de leucocitos) y también efectos indirectos sobre crecimiento y diferenciación celular hematopoyética. Hasta el momento se comercializa una forma recombinante de interleucina 2.

INTERFERONES. Los de tipo I (alfa y beta) con efectos antivirales y antiproliferativos y el tipo II (gamma) con propiedades

inmunomoduladoras.

Interaccionan con receptores de membrana pero el efecto ocurre en el núcleo mediante regulación de expresión de determinados genes y la represión de otros.

FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF): hace referencia a la capacidad de esta citocina para provocar necrosis en algunos tumores pero participa también en la respuesta inmunitaria.

El único utilizado por el momento con fines terapéuticos es el TNF-alfa.

3. ENZIMAS

Enzimas empleadas en TERAPIAS DE RESTAURACIÓN: tratamiento de cuadros de deficiencia congénita o adquirida de determinadas enzimas implicadas en pasos metabólicos específicos.

ENZIMAS ANTITROMBÓTICAS. Enzimas recombinantes que tienen por misión estimular el sistema fibrinolítico endógeno.

En cuanto a la especificidad, los agentes antitrombóticos pueden ser clasificados principalmente en: agentes inespecíficos o fibrinolíticos (estimulan la fibrinolisis donde existe plasminógeno) y los específicos o trombolíticos (activan la fibrinolisis donde hay fibrina).

FACTORES DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA. Las formas recombinantes no presentan ventajas adicionales frente a productos obtenidos mediante extracción salvo la disponibilidad y la reducción del riesgo de contaminación biológica.

4. PROTEÍNAS HORMONALES

INSULINA. Todas las insulinas comercializadas tienen un origen biotecnológico.

Modificaciones en la estructura molecular de la insulina pueden adelantar el comienzo de la acción y emular el perfil cinético de la insulina fisiológica o producir un efecto mantenido a lo largo de más tiempo (liberación más lenta).

GONADOTROPINAS HIPOFISARIAS. Hormonas de naturaleza glucoproteica que actúan en la iniciación y regulación de la gametogénesis.

PROTEÍNA OSTEOGÉNICA 1: induce la formación de nuevo hueso fisiológicamente normal.

HORMONAS SECRETADAS POR EL LÓBULO ANTERIOR DE LA HIPÓFISIS:

La SOMATOTROPINA tiene un origen recombinante en todos los fármacos comercializados.

La HORMONA PARATIROIDEA ó PARATHORMONA (PTH) como estimuladora de la formación ósea.

5. VACUNAS

Sólo una pequeña minoría de las vacunas comercializadas en

España son recombinantes.

Para virus que el sistema inmune no es capaz de eliminar totalmente en ocasiones, cronificándose la infección y con potencial tumoral que se puede manifestar a largo plazo.

Crecen mal en cultivos de tejido.

VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB). La partícula infectiva tiene forma esférica y presenta una capa lipídica externa en la que se insertan múltiples copias de la proteína viral, que es el antígeno de superficie para proteger frente a la infección clínica del VHB.

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. Presenta una capa externa formada por dos proteínas: L1 y L2. La L1 es la proteína más importante para inducir la respuesta inmunitaria protectora.

FÁRMACOS BIOSIMILARES

Las copias de los fármacos biotecnológicos se conocen como BIOSIMILARES.

Son producidos por un fabricante diferente del original, utilizando nuevas líneas celulares, nuevos procesos y nuevos métodos analíticos.

Pueden existir diferencias en cuanto al producto final que ocasionen ciertas características específicas a nivel de la actividad del medicamento o la aparición de determinados efectos adversos por la inmunogenicidad que pueden desarrollar.

Ej: diferencias en la glucosilación de las epoetinas (eritropoyetinas) biosimilares pueden ocasionar diferencias de hasta un 20% en la actividad con respecto al original porque la glucosilación determina la actividad biológica de la proteína.

OTRAS APLICACIONES DE BIOTECNOLOGÍA: PRUEBAS GENÉTICAS

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Los marcadores microsatélites también se conocen como STRs (Short Tandem Repeats).

Se emplean comúnmente en la identificación humana debido a que son muy polimórficos (gran poder de discriminación), tasa de mutación relativamente baja, tamaño pequeño y ubicación cromosómica establecida.

Varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultánea (multiplex).

El CODIS (Combined DNA Index System), es la base de datos de DNA creada por el FBI (USA).

El CODIS utiliza un conjunto estándar de 13 regiones STRs específicos.

AMELOGENINA Discriminación del sexo

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD Número de alelos para cada locus STR del CODIS

ACTIVIDAD MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Primer paso: Elaboración del árbol genealógico de una familia

Segundo paso: Recopilación datos análisis STR

Ejercicio: recopilar la información de los 3 marcadores para todos los individuos de la familia de Bob.

Ejercicio1 : Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina, ¿apoyan todos los datos sobre los genotipos de Bob, Ana, María, y David la posibilidad de que Bob y Ana son los padres biológicos de María y David?

Ejercicio 2: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Los alelos que Bob transmite a sus descendientes los heredó a su vez de Alfredo y Nuria. Identificar los alelos de los genotipos de María y David que se han heredado sin ambigüedad de cada uno de sus abuelos paternos.

Ejercicio 3: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Si no se conoce el perfil genético de Esteban pero se sabe con certeza que es el padre de Teresa, Mónica y Esther junto con su mujer Luisa, ¿qué predicciones podríamos hacer acerca de su composición para cada uno de estos marcadores?

CLONACIÓN DE ORGANISMOS

«Desde el punto de vista genético un clon no es otra cosa que un gemelo que viene al mundo con retraso» (Jens Reich).

Primeros animales en ser clonados: ranas.

Primer mamífero clonado: DOLLY en el Instituto Rosalina (Escocia).

Procedimiento:

– Extracción de células de glándula mamaria de oveja

– Cultivo celular

– Núcleos celulares se inyectan en óvulo enucleado de otra raza de oveja

– Desarrollo embrionario que da lugar a oveja clonada (Dolly: 5 de julio de 1996)

Dolly: clonación a partir de una célula de glándula mamaría por transferencia de su núcleo a un óvulo enucleado.

CONCLUSIONES:

Una célula somática puede «olvidar» todas las especificidades (diferenciación) y actuar como si fuera un óvulo fecundado «totipotente».

Procedimiento poco eficiente: la mayoría de ovejas gestantes tuvieron abortos.

Se ha descubierto que algunos animales clonados poseen telómeros más cortos que sus congéneres de la misma edad.

DIFICULTADES:

– El núcleo celular procede de una célula corporal diferenciada, en la cual ciertos genes están bloqueados. Para poder reprogramar el DNA bloqueado se deben mantener los núcleos de las células somáticas en un medio de cultivo pobre en nutrientes.

– El núcleo celular del donante está dañado de antemano por la luz UV, radicales de oxígeno reactivo (ROS) y sustancias tóxicas.

– La interacción entre óvulos enucleados y núcleos celulares no funciona sin fallos. El plasma celular del óvulo controla la función del núcleo celular correspondiente.

– El clon no es una copia exacta del donante: el DNA mitocondrial procede de la donante de óvulos. Clon genómico.