LECTURA
–EN AGAR MAC CONKEY, observar las colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
–EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las colonias que son SH2.
–EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las características.
–EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos, el medio toma un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
–EN LIA (Agar, Lisina, Hierro), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio debido a la producción de aminas, pH= 5.2 (color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador púrpura de bromocresol]
–EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovac tornándose rojo grosella.
–EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de energía y alcaliniza el medio (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo (color verde).
–EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo).
–EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo (color amarillo).
–PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima, en caso contrario no habrá ningún cambio de color.
–COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
–CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos.
PRACTICA Nº 25: ESTUDIO E IDENTIFICACION DE *VIBRIO CHOLERAE*
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los géneros: *Vibrio*, *Aeromonas* y *Plesiomonas*. El género *Vibrio* comprende muchas especies, siendo las de importancia médica *Vibrio cholerae*, causante del cólera epidémico; *V. parahaemolyticus*, causante de gastroenteritis; *V. vulnificus*, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas, celulitis; y *V. alginoliticus*, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 μm, se presentan solos, en parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo.
La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
- Placa Petri con medio TCBS sembrada con *V. cholerae* y *V. parahaemolyticus*
- Tubos con TSI
- Tubos con LIA
- Tubo con Caldo peptonado
- Tubo con MR-VP
- Tubo con Citrato de Simmons
- Desoxicolato de sodio al 0.5 %
- Láminas portaobjetos
- Set de coloración de Gram
- Microscopios
- Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
- En Agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de *V. cholerae*, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a partir de la utilización de la sacarosa).
En Agar TCBS las colonias de *V. parahaemolyticus* se observan colonias circulares, de aspecto verde- gris translúcido; *V. alginolyticus* se observa de color amarillo (sacarosa positiva).
- En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la sacarosa, no produce H2 S.
- En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol.
- En el medio LIA, observar si hay decarboxilación de la Lisina.
- En el medio MR-VP, detectar la producción del acetil-metil-carbinol.
- En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio.
- Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram.
- Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de Desoxicolato sobre una lámina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de *V. cholerae*, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una cuerda larga” que se torna más pegajosa después de 60 segundos más.
- Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados.