Técnicas de Manipulación del ADN
Fragmentación del ADN
Las endonucleasas de restricción, también denominadas restrictasas o enzimas de restricción, son enzimas capaces de romper el ADN. Estas enzimas reconocen y cortan el ADN en puntos concretos de la secuencia de nucleótidos, que son las llamadas secuencias diana.
Utilización de un Vector
Un vector es el encargado de introducir un determinado fragmento de ADN en otras células.
Plásmidos
Las bacterias poseen una molécula de ADN bicatenario circular en la que portan la mayoría de su información genética. Pero además, poseen unas pequeñas moléculas de ADN, también bicatenarias y circulares, denominados plásmidos, de los que puede haber varios ejemplares en una misma bacteria.
Unión de un Fragmento de ADN a un Vector: ADN Recombinante
La técnica consiste en cortar el ADN pasajero y el vector con la misma enzima de restricción.
Introducción de ADN Extraño
Una vez obtenido el vector con el ADN extraño, hay que incorporarlo a una célula viva que lo ha de incorporar a su patrimonio genético. La técnica a emplear será diferente según el vector utilizado y el tipo de célula receptora. La transformación en bacterias se consigue alterando las condiciones del medio para aumentar la permeabilidad de la membrana al ADN. Si el vector es un virus, él ya posee los mecanismos de introducción del ADN propio y extraño. Cuando se utiliza el plásmido Ti con células vegetales, la propia bacteria tiene sus mecanismos para introducir el plásmido. Transformación es la introducción de ADN extraño en bacterias, de forma natural o facilitada por vectores. Si se introduce en células eucariotas se emplea el término transfección. Si la inoculación del ADN extraño se realiza en las células reproductoras de animales o plantas, se denomina transgénesis, llamándose a estos organismos transgénicos.
Clonación del ADN
Clonación de ADN
Se ha conseguido fragmentar todo el genoma de una especie (por ejemplo, la humana), introducir los fragmentos en bacterias utilizando vectores como los plásmidos y conseguir clones de bacterias, que contienen cada uno de ellos un determinado fragmento de restricción. Por tanto, tenemos clones de ADN.
Clonación de un Gen
Se localiza el clon que contiene el fragmento adecuado. Luego se vuelve a fragmentar, y se localiza el pequeño fragmento que contiene el gen. La obtención de un clon de un determinado gen tiene una enorme importancia, sobre todo cuando lo que pretendemos es obtener una determinada proteína de interés, como la insulina, a partir de bacterias que contienen y expresan dicho gen.
Expresión de los Genes Incorporados
La posibilidad de introducir un gen en bacterias puede servir para clonar dicho gen. Esto parece aún mucho más interesante: la posibilidad de que ese gen se exprese y se origine el producto proteico correspondiente (tras los procesos de transcripción y traducción).
Problemas y Soluciones:
- Los genes eucariotas presentan intrones y los de las bacterias no. En lugar de introducir el fragmento de ADN humano original en la bacteria, lo que se ha hecho es lo siguiente, sin la información de los intrones:
- Aislar ARN-m propio de la insulina.
- Sintetizar un ADN complementario por medio de la retrotranscriptasa inversa.
- Este ADN, al ser copia del ARN-m maduro, carece de intrones.
- El ADNc se introduce en un vector y se transforma a las bacterias. (ADN recombinante).
- El ADNc carece del promotor y otras secuencias de interés. El ADNc se obtiene del ARN-m, por lo que carece de promotor y terminador, con lo cual no se produce la transcripción del gen dentro de las bacterias. Aunque el ADN insertado tuviera esas regiones promotoras y terminadoras, no servirían, pues dichas regiones son diferentes entre bacterias y células eucariotas. La única solución ha sido cortar las secuencias promotoras de bacterias y unirlas al ADNc humano.
Secuenciación del ADN
Saber el orden en el que se encuentran cada uno de los nucleótidos en el ADN.
Aplicaciones de la Ingeniería Genética
Proteínas de Interés Terapéutico Producidas por Bacterias
La insulina, hormona del crecimiento, interferón, el factor VIII de la coagulación y vacunas.
Terapia Génica
Consiste en introducir el gen correcto en células de un ser vivo que tiene una mutación que le provoca una enfermedad. La terapia de las células somáticas se está llevando a cabo de tres maneras diferentes:
- Terapia ex vivo (fuera del cuerpo): Se extraen células con genes defectuosos y se le introducen, mediante vectores adecuados, copias del gen normal. Estas células transfectadas se vuelven a implantar en el ser vivo.
- Terapia in situ (en el mismo lugar): Se introducen los vectores unidos a los genes correctores directamente en los tejidos donde se necesitan esos genes. Esta técnica se está ensayando para tratar la fibrosis quística, enfermedad genética por mutación de un solo gen y que afecta a los pulmones dificultando seriamente la respiración.
- Terapia in vivo: Esta es la esperanza del futuro. Consiste en inyectar en la sangre los vectores con el gen adecuado.
Aplicaciones de la Ingeniería Genética en la Medicina
- Diagnóstico de enfermedades genéticas.
- Medicina forense y medicina legal.
- Delitos en los que no hay testigos y la víctima muere o no puede reconocer al agresor.
Aplicaciones de la Ingeniería Genética en la Agricultura: Plantas Transgénicas
Las principales aplicaciones de la ingeniería genética en la agricultura se centran en la obtención de las llamadas plantas transgénicas. La introducción de estos genes extraños en células eucariotas es más complicado que en bacterias. Algunos de los principales logros obtenidos son los siguientes:
- Obtención de distintas variedades transgénicas del maíz.
- Obtención de variedades transgénicas del trigo más nutritivas y más resistentes a las plagas y a los herbicidas.
- Obtención de una variedad de tomate que madura más lentamente.
Aplicaciones de la Ingeniería Genética en la Producción Animal: Animales Transgénicos
Las principales aplicaciones de la ingeniería genética a la mejora de la producción animal se han realizado en peces.
- Carpas transgénicas: Crecen entre un 20 y un 46% más rápidamente gracias al gen de la hormona de crecimiento de la trucha arco iris.
- Salmones transgénicos: Resisten mejor las bajas temperaturas gracias a la incorporación de un gen de una especie que vive en el Ártico.
Proyecto Genoma Humano
El conocimiento de la secuencia normal de nucleótidos permitirá tener una referencia para la terapia génica. Una vía de trabajo ha sido conocer en qué orden están los genes y a qué distancia entre ellos (mapa génico humano). Otra vía es descifrar la secuencia de nucleótidos (secuenciación) de cada gen. Está secuenciado totalmente el 100%.