Métodos de Diagnóstico Virológico
a. Uso de los Huevos Embrionados para la Propagación de los Virus
Muchos virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos embrionados de gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces están siendo ampliamente usadas.
Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser inoculado.
Materiales
- Huevos embrionados de 7-9 días.
- Huevos embrionados de 10-12 días.
- Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.
- Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
- Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada
- Frascos con Alcohol yodado
- Algodón
- Ovoscopio
- Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
- Equipo de disección (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
b. Inoculación del Colorante por Vía Alantoidea
- Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 días.
- Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevos embrionados.
- Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de 45° e inocular 0.2 ml. de colorante.
- Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por 2-4 días, luego cosechar y observar.
c. Inoculación por Vía Amniótica
- Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días.
- Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón.
- Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
- Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana amniótica, formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de metileno o del inoculo problema.
- Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
- Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35°C por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)
d. Inoculación del Saco Vitelino
- Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo embrionado de 6-7 días.
- Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.
- Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.
- Sellar la abertura
e. Cosecha de los Líquidos (Según las Cavidades Inoculadas)
- Comprobar que el embrión este vivo. Enfriar a 4°C los huevos embrionados por algunas horas (2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones.
- Cortar la cáscara que cubre la cámara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.
- Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localización del Azul de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculación (Membrana alantoidea, amniótica, corioalantoidea y saco vitelino).
- Cosechar las membranas en estudio y extraer el líquido alantoideo, amniótico y realizar las pruebas de diagnóstico correspondientes según la investigación solicitada
f. Inoculación en Ratones Lactantes
Se utilizaran ratones lactantes y las vías de inoculación serán: Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutánea y Nasal.
g. Observación de Láminas Coloreadas
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión (Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su localización es específica de la enfermedad viral.
Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto citopatico) como conglomerados de virus asociados a productos de reacción de la célula infectada.
h. Observación de Láminas
- Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado el citoplasma.
- Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusiones eosinofilas intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.
- Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el borde de la célula.
- Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
- Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en “ojos de lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).
- Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las inclusiones basófilas intranucleares.
Protocolo
Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.