Fundamento
El radioinmunoensayo (RIA) utiliza isótopos radiactivos (inestables) como marcadores. Estos isótopos experimentan procesos de desintegración radiactiva para dar lugar a isótopos estables. La molécula marcada se denomina trazador. Se utilizan marcadores isotópicos internos (como 14C, 3H) y externos (como 125I).
El RIA consiste en enfrentar la sustancia buscada en la muestra problema a una molécula marcada con un radioisótopo. Posteriormente, se realiza la lectura de los resultados mediante el recuento de la radiactividad desprendida del complejo formado. Los radioisótopos más utilizados emiten radiaciones gamma, como el 125I, aunque algunos emiten radiaciones beta, como el tritio (3H).
En el marcaje de la molécula con yodo, este se incorpora a los aminoácidos aromáticos: tiroxina, fenilalanina, triptófano o histidina.
Técnica
El RIA es una técnica no homogénea, es decir, requiere la separación de las moléculas marcadas que se han unido a los complejos inmunes (fracción ligada) de las que no están fijadas (fracción libre) antes del análisis de la radiactividad.
Esta separación se puede realizar de diferentes maneras:
- Precipitar la fracción ligada y dejar en disolución la fracción libre.
- Adsorción de la fracción libre a productos como el carbón activado o el talco.
- Recubrir un soporte sólido (tubo o pocillos de una placa) con antígeno o anticuerpo al que se unirán los reactivos marcados con el radioisótopo. Tras ello, la fracción libre se elimina fácilmente mediante lavado. Este es el método más utilizado (determinación en fase sólida).
Se utilizan detectores de ionización, como el contador de centelleo. La radiactividad se mide en cuentas por minuto (CPM).
Características
- Muy sensible
- Aparatos costosos
- Riesgo para la salud de quienes la realizan
Los sistemas de ELISA, fluorescencia, etc., han producido pruebas tan sensibles como el RIA, pero sin los riesgos y problemas de eliminación de material asociados con los reactivos radioactivos.
Tipos de RIA
RIA de competición
El RIA de competición se basa en la competencia entre un antígeno sin marcar y una cantidad conocida del antígeno marcado (Ag*) por el anticuerpo (Ac). Manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac, se observa que a mayor cantidad de antígeno (Ag) en la muestra, menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac (y por lo tanto, menor radiactividad presenta). Esto permite relacionar la radiactividad con la concentración de Ag.
RIA indirecto o en fase líquida
- Se inmoviliza una cantidad constante de Ag en un soporte sólido (tubo o placa) y se lava.
- Se añade la muestra problema con los anticuerpos (Ac) a determinar y se lava.
- Se añade una cantidad constante de anti-Ac marcado (conjugado) y se lava.
- Se mide la radiactividad en la placa con un contador.
IRMA
- Se inmoviliza una concentración fija de Ac (no marcado) en un soporte sólido y se satura.
- Se añade la muestra problema (o de calibrado) de Ag.
- Se añade Ac* (marcado) que se une a otro epítopo del Ag y se lava.
- Se determina la cantidad de Ac marcado unido.
- Se interpola el valor obtenido en una recta patrón para determinar la concentración de Ag.
RIST
El RIST (Paper Radio Immuno Sorbent Test) se utiliza para la detección de IgE totales. Se basa en la competencia entre IgE e IgE* por unirse a anti-IgE fijada a un disco de papel. Cuanto más IgE haya en el suero, menos IgE* se unirá.
RAST
El RAST detecta IgE específicas. Su fundamento es similar al ELISA indirecto. Los pasos son idénticos a los del RIA básico en fase sólida, salvo que el antígeno (alérgeno) se une a un disco de celulosa. La mayor disponibilidad de antígeno en el disco aumenta la sensibilidad para unir las pequeñas cantidades de IgE específicas presentes en el suero problema.