Hibridación o Annealing
Temperatura variable de 30-65ºC (a mayor Tª mas especificidad, varía en función del cebador). Contra mayor tamaño del cebador mayor tiempo de unión (mas puentes de H): Sucede tras la desnaturalización a altas Tª (rotura de puentes de H entre bases nitrogenadas obteniendo 2 cadenas monocatenarias), al producirse el enfriamiento el ADN puede volver a formar puentes de H entre bases complementarias de manera espontánea, así podemos añadir fragmentos de ADN complementarios exógenos al genoma (cebadores, sondas). Se une el cebador o la sonda (contiene fluoróforo en la PCR en tiempo real) a la cadena de ADN monocatenaria por complementación de bases específica y establece grupo OH libre en 3´ donde la polimerasa en la fase de extensión o elongación comienza a añadir nucleótidos. Cada cebador tiene una secuencia complementaria distinta, de ahí la importancia de su elección según el fragmento que se quiera amplificar. Uso: PCR con cebadores y sondas (PCR tiempo real), clonación basada en células (tamaño de los fragmentos mayores a los que permite la sensibilidad PCR) y en transferencia a membranas.
Diseño de Primers
Propiedades: Debe ser específico (unión por complementariedad de bases) del fragmento de ADN, tras este se efectuará la fase de elongación en extremo 3´ por la polimerasa. No se debe unir a otros fragmentos. Tiene que tener afinidad suficiente para no sufrir desnaturalización en fase de elongación por el aumento de Tª. Aumenta la especificidad con el aumento de tamaño (mayor número de bases complementarias), así como la afinidad y el tiempo de hibridación. El extremo 3´ donde se sitúa el OH libre que marca el inicio de la acción de la polimerasa debe estar libre. Composición de bases: contenido GC 40 a 60% y distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.
Marcaje de Sondas
La sonda posee una región complementaria que varía entre específicas (todo) y no específicas (región bucle). Contiene fluoróforo unido al extremo 5´ y el quencher al 3´. También se puede marcar con señal en extremo cadena ADN.
Electroforesis en Geles
Técnica de separación de moléculas (ADN, ARN, proteínas) según tamaño y carga eléctrica (tamización por gel) en una cámara de electroforesis. Puede ser tras una PCR o por fragmentos formados por endonucleasas de restricción. Esto es posible gracias a una matriz porosa por la que difunden las moléculas con carga atraídas por fuerzas eléctricas opuestas del electrodo, según el tamaño varía la velocidad de difusión y el avance por el gel que ofrece resistencia.
Tipos de Gel
a. Poliacrilamida: Solo sirve para fragmentos cortos de ADN, tiene más precisión en los resultados.
b. Agarosa: Formado por polisacárido en disolución buffer. Para poder ver el avance de las partículas el gel o los fragmentos deben estar teñidos: Tinción con SYBR: Agente intercalante más seguro. Bromuro de etidio: Agente intercalante que emite fluorescencia bajo luz UV.
Parámetros Componentes Analizables
Moléculas ADN doble cadena: Se utiliza por ejemplo tras una PCR. Las moléculas de ADN tienen estructura lineal estable y carga negativa, es atraído por fuerzas eléctricas positivas del electrodo.
Moléculas ARN: Posee carga negativa (atraído por electrodo positivo) pero son monocatenarias por lo que pueden formar estructuras alternas que dificultan la difusión por el gel. Se utiliza glioxal para evitar estas estructuras.
Proteínas: No tienen carga estable, varía según aa. Pueden formar estructuras variables que dificultan difusión por gel. Se utilizan alcoholes para prevenir formación estructuras variables, y soluciones iónicas (dodecil sulfato de sodio) o diferentes pH para dar carga negativa a las proteínas.
Transferencia a Membranas
Tras la electroforesis se obtienen las partículas separadas según carga y tamaño, se transfieren a una membrana por atracción eléctrica para su visualización y análisis. Se utilizan diferentes métodos según si analizamos ADN, ARN o proteínas. Uso: Identificación de los fragmentos deseados (contienen gen, alelo) por detección por fluorescencia mediante hibridación de sondas, o proteínas mediante formación inmunocomplejos.
Hibridación Southern Blot con ADN
Se requieren fragmentos pequeños, por lo que se deben digerir antes de la electroforesis con endonucleasas de restricción.
Proceso:
1. El gel de electroforesis se introduce en disolución alcalina para desnaturalizar hebras ADN (romper enlaces puentes H entre bases complementarias formando fragmentos monocatenarios) y que puedan salir fácilmente del gel, se lava con disolución buffer como la de la electroforesis.
2. Se coloca membrana nitrocelulosa encima del gel y por atracción electrostática (tiene carga positiva y el ADN negativa) se transfieren el ADN haciendo una copia de la electroforesis.
3. Se realiza hibridación de la membrana con disolución que contiene sondas (contienen fluoróforo) complementarias específicas de los fragmentos de estudio. Se lava la membrana para eliminar sondas que no se unen.
4. Los fragmentos que han sido marcados se observará fluorescencia.
Hibridación Northern Blot con ARN
Transferencia de RNA de un gel a un soporte sólido.
Como las moléculas de RNA son relativamente cortas (normalmente
Protocolo similar a Southern blot.
Nos permite comparar que en diferentes tejidos extraigo el ARN mensajero y veo si hay una expresión diferencial en otros tejidos por comparación entre ellos. Nos dice en que tejidos se expresa más o menos, a la hora de ver patrones de expresión.
APLICACIÓN: La hibridación de una sonda puede revelar el tamaño de una molécula de mRNA particular, su abundancia relativa o los tejidos en los que se transcribe (PATRONES DE EXPRESIÓN DE GENES ESPECÍFICOS).
Inmunotransferencia Western con Proteínas
Transferencia de la proteína de un gel a una membrana.
Las proteínas separadas por electroforesis se transfieren y unen a un filtro, que luego se incuba en una solución con un anticuerpo contra la proteína purificada en cuestión.
Se incuba con el anticuerpo específico de esa proteína, y para visualizar si se ha unido o no se usa una enzima cromogénica.
Se utiliza una enzima cromogénica para detectar el anticuerpo unido al filtro.
APLICACIÓN: determinar el tamaño de una proteína particular y su patrón de expresión.
Secuenciación de Ácidos Nucleicos
Secuenciación del DNA
SECUENCIACIÓN DEL DNA
El principio básico de la secuenciación es la separación de los grupos de moléculas de DNA de acuerdo con su tamaño.
Secuenciar: conocer el orden de nucleótidos.
El método de secuenciación más usado: método de terminación de la cadena o método didesoxi (Sanger).
Este método se basa en la replicación.
Tenemos una secuencia molde y queremos obtener la complementaria.
El fragmento que se va a secuenciar se utiliza como molde para sintetizar una serie de nuevas moléculas de DNA.
Se utilizan unos nucleótidos especiales: didesoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTP) que son idénticos a los dNTP pero carecen del grupo 3′-OH. En lugar de añadir los dNTP añadimos ddNTP. La diferencia entre ambos es el extremo 3’, en los ddNTP les falta el grupo OH en el extremo 3’, como consecuencia no se podrá seguir con el método.
En el transcurso de la síntesis de DNA se incorporan los ddNTP y una vez que se han incorporado no pueden agregarse más nucleótidos.
Las muestras se dividen en 4 porciones que se colocan en tubos de reacción diferentes al que se le agrega: primer, dNTPs, un ddNTP diferente a cada tubo, DNA polimerasa.
La incorporación de ddNTP ocurre al azar en diferentes posiciones en las distintas copias: se genera un conjunto de cadenas de DNA de diferentes longitudes que se visualizan en geles de poliacrilamida.
Dibujar las bandas que deberían aparecer en el gel de poliacrilamida a partir de las cuatro reacciones de secuenciación del siguiente fragmento de DNA:
Los secuenciadores automáticos parten de los mismos principios de la secuenciación de terminación de la cadena pero utilizan ddNTP marcados fluorescentemente (colores diferentes para cada ddNTP) y escáneres con láser.
Las cuatro reacciones de secuenciación pueden realizarse en el mismo tubo y colocarse en la misma calle para la electroforesis (tubos capilares).
Los fragmentos pasan por el láser, sus marcas fluorescentes se activan y la fluorescencia se detecta en un lector óptico.
Pirosecuenciación
Se basa en la secuenciación por síntesis junto con una reacción quimioluminiscente.
Tienen lugar cuatro reacciones enzimáticas en un tubo en el que se monitoriza la síntesis de la cadena complementaria de DNA.
Enzimas:
- – DNA polimerasa
- – ATP sulfurilasa
- – luciferasa
- – apirasa
Se produce luz, de forma proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporados.
La generación de luz se detecta en forma de pico y se graba gracias a un sistema de detección.
Reacciones enzimáticas:
1) DNA polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a la cadena de DNA molde. Si se incorporan se libera pirofosfato inorgánico (PPi) proporcionalmente a cantidad de dNTP.
2) ATP- sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de APS (adenosina-5′-fosfosulfato).
3) El ATP permite conversión de luciferina en oxiluciferina por luciferasa y genera luz visible proporcional a la cantidad de ATP.
4) Apirasa degrada dNPS no incorporados.
APLICACIONES PRINCIPALES: Secuenciación de fragmentos cortos de DNA, detección de SNPs y análisis de metilación.
SECUENCIACIÓN DEL DNA
Programa informático para comparar secuencias: alineamiento de secuencias e identificación de polimorfismos/snps: BIOEDIT
¿Cómo interpretaríais este resultado de secuenciación de un fragmento de gen específico amplificado por PCR?
En la posición 201 presenta 2 picos. Se ha secuenciado por el método didesoxi, una lectura continua de picos, pero no nos indica proporciones. Lo que le pasa es que es heterocigoto para esa posición, su padre tenía una C y su madre una T
Vectores
Método de Clonación de DNA Basado en Células
Clonación de DNA: capacidad de formar moléculas de DNA recombinantes y mantenerlas en las células.
El proceso típico es el empleo de un VECTOR que aporta la información necesaria para propagar el DNA clonado hacia la célula (hospedador) y un INSERTO de DNA que se introduce dentro del vector y presenta el DNA en cuestión.
Base del procedimiento: crear moléculas recombinantes mediante el empleo de enzimas de restricción y otras enzimas que unen entre sí los fragmentos de DNA seccionados.
APLICACIONES:
- Purificar un inserto determinado de DNA y aislarlo del resto
- Amplificación de un fragmento de DNA para producirlo en grandes cantidades
Vectores
Los vectores de DNA típicos tienen tres características:
1) Un origen de replicación que les permita replicarse en forma independiente del cromosoma del hospedador.
2) Algún tipo de marcador seleccionable que les permite identificar con facilidad las células que contienen el vector (junto con cualquier fragmento de DNA).
3) Sitios independientes para la unión de una enzima de restricción o varias. Permite la inserción de los fragmentos de DNA en un punto específico dentro de un vector íntegro. Como se conoce el genoma de los vectores sabemos donde de va a producir el inserto.
Plásmidos
Plásmidos = moléculas DNA circular (naturalmente en bacterias).
Se corta el DNA y el plásmido con la misma enzima de restricción y se mezclan.
La DNA ligasa sella las uniones en el esqueleto de azúcares fosfatados: plásmido recombinante.
El plásmido recombinante se introduce en células bacterianas mediante TRANSFORMACIÓN: capacidad de las células bacterianas de captar el DNA del ambiente externo, de forma natural o previo tratamiento químico o físico.
Los plásmidos se replican.
Las células que portan plásmidos recombinantes pueden detectarse mediante el empleo de marcadores de selección:
Gen /acZ. Cuando se inserta DNA extraño en el sitio de restricción se altera el gen y la β-galactosidasa no se produce. Se añade X-gal en el medio de cultivo: β-galactosidasa lo degrada y produce una sustancia de color azul.
¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO RECOMBINANTE!!!
Gen que confiere resistencia a un antibiótico (ampicilina). Se añade al medio de cultivo el antibiótico.
¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO!!
Las que no tiene el inserto tiene β-galactosidasa…
Otros Vectores
Bacteriófagos = virus que infecta a bacterias.
Cósmidos = plásmidos empaquetados dentro de cápsides proteicas virales vacías.
Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son vectores inicialmente construidos a partir del plásmido F (plásmido especial que controla el apareamiento y la transferencia de material genético en algunas bacterias).
Vectores de Expresión
Si el objetivo de la clonación génica es también producir la proteína que codifica se debe incluir el gen en un vector de expresión.
Contiene secuencias necesarias para la transcripción y la traducción en las células bacterianas.
Otros Vectores de Clonación
Existen vectores de clonación que permiten la inserción de genes en células eucariontes.
Sirven para incluir modificaciones esenciales que deben sufrir las proteínas tras su traducción para ser funcionales.
YAC= cromosoma artificial de levadura. Es una molécula de DNA con un origen de replicación de levadura, un par de telómeros y un centrómero.
Los YAC son estables, se replican y segregan de la misma forma que los cromosomas de la levadura.
Pueden transportar fragmentos de DNA de 600 Kb.
Genoteca
GENOTECA = colección de clones que contiene todos los fragmentos de DNA provenientes de una fuente.
1) GENOTECA GENÓMICA: cortar el DNA genómico con enzimas de restricción durante un período limitado (digestión parcial) para conseguir cortes en algunos sitios de restricción en cada molécula de DNA.
Se producen un conjunto de fragmentos superpuestos.
Número de clones elevado para contener una representación de todo el genoma (depende del vector).
2) GENOTECA DE cDNA: a partir de secuencias de DNA que se transcriben en mRNA. Es una genoteca de ADN complementario.
Ventajas:
- Enriquecida con fragmentos de genes transcritos en forma activa.
- Los intrones no interrumpen las secuencias clonadas (las bacterias no pueden eliminarlos).
Desventaja: contiene sólo secuencias que están presentes en el mRNA maduro y que se expresan en el tejido a partir del cual se aisló el RNA.
Requiere de un primer paso en el cual se separa el mRNA del resto.
Colony Blot
Las células se diluyen y se siembran en placa de manera que cada bacteria crezca en una colonia separada.
Cada placa o colonia bacteriana contiene un fragmento de DNA clonado que debe evaluarse para encontrar el gen de interés.
Las placas o colonias deben transferirse a membranas
La búsqueda en colonias se realiza mediante el empleo de sondas complementarias.
Proceso de Obtención de Fármacos de Origen Biotecnológico
La mayoría de los fármacos tradicionales son compuestos orgánicos que contienen un grupo limitado de grupos funcionales.
Los fármacos obtenidos mediante procesos biotecnológicos son, sobre todo, las proteínas terapéuticas que pueden contener cientos de aminoácidos.
A los pacientes no les importa si el fármaco ha sido obtenido por medios químicos o biotecnológicos: SÓLO QUE FUNCIONE.
Los procesos de producción biotecnológicos son más complejos que los procesos tradicionales de producción de fármacos.
La mayoría de los fármacos elaborados mediante métodos biotecnológicos son proteínas que son altamente sensibles a cambios en su entorno.
Su estructura depende de diversas interacciones, a menudo débiles, entre los aminoácidos.
Estas interacciones están óptimamente coordinadas sólo en un margen estrecho de condiciones ambientales que corresponden precisamente a aquellas que se encuentran en el organismo del cual derivan las proteínas.
Incluso cambios relativamente pequeños en la temperatura, concentración de sales o pH de la solución pueden dañar la estructura y por tanto neutralizar la función de la proteína.
La mayoría de estas moléculas actúan como mensajeros químicos en el cuerpo.
Las células diana que reciben y traducen las señales tienen receptores especiales en su superficie en las cuales el correspondiente mensajero químico encaja perfectamente.
Si la estructura tridimensional del mensajero químico se altera ligeramente, la molécula no será reconocida por su receptor y será inactiva.
La situación es similar con otro grupo de proteínas terapéuticas: los anticuerpos.
En la biosíntesis natural de proteínas, en las células del cuerpo, una serie de enzimas se encargan de la correcta formación de las estructuras proteicas.
La producción de proteínas no puede realizarse mediante métodos químicos.
La mayoría de fármacos obtenidos mediante la aplicación de la biotecnología se producen en cultivos de microorganismos y células de mamíferos.
Cuando las sustancias constan de varias proteínas o sustancias que tienen que ser modificadas por adición de grupos no proteicos como cadenas de azúcares se deben emplear cultivos de células de mamífero.
Las células son organismos vivos y reaccionan incluso a pequeños cambios en su ambiente, no sólo a factores controlables como en la síntesis química convencional sino también a la solución de nutrientes y cualquier objeto o sustancia que entre en contacto con ellas.
Cada planta de producción biofarmacéutica es esencialmente única.
Los laboratorios y las empresas biotecnológicas trabajan con líneas celulares específicas que están muy estudiadas y susceptibles de estandarización.
Los investigadores biotecnológicos insertan genes estructurales y de control en las células de las líneas para producir el fármaco.
La nueva línea celular creada se trata normalmente como un secreto empresarial.
Se guardan como un banco celular que se conserva a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196°C para conservación a largo plazo).
El proceso de producción consiste en 4 pasos principales:
1) CULTIVO. Las células se transfieren del banco celular criogénico a un medio líquido con nutrientes que les permiten reproducirse.
La longitud de este paso depende del tipo de célula usada.
En condiciones favorables las células bacterianas se dividen una vez cada 20 minutos y las células de mamíferos se dividen una vez cada 24 horas.
Durante la fase de crecimiento el cultivo celular se transfiere a recipientes de cultivo de mayor tamaño progresivamente.
2) FERMENTACIÓN. El medio de cultivo contiene las sustancias necesarias para la síntesis de la proteína terapéutica deseada.
El medio de cultivo contiene alrededor de 80 constituyentes diferentes en esta etapa.
Los recipientes en los que tiene lugar la fermentación tienen capacidades de unos 10000 litros (limitaciones tecnológicas y biológicas).
3) PURIFICACIÓN.
Si las células cultivadas secretan el producto en la solución ambiente, se separan las células del medio de cultivo (centrifugación, filtración) y el producto se aisla tras varios pasos de purificación.
Si el producto permanece en el interior de las células, las células se aislan, digieren y los desechos celulares se separan de la solución junto con el producto.
El rendimiento de procesos de bioproducción es generalmente menor que la síntesis química.
Tanto la purificación como el análisis de de cada lote de producto final duran varias semanas. Se requiere un nivel de pureza de 99,9 % para aprobación.
4) FORMULACIÓN.
Las proteínas sensibles se deben convertir en formas farmacéuticas estables y deben ser guardadas, transportadas y finalmente administradas en condiciones de seguridad.
A lo largo de estos pasos se debe salvaguardar la integridad estructural de la molécula para mantener su eficacia.
La naturaleza sensible de muchos fármacos de origen biotecnológico hace que se deban emplear soluciones especiales en las que el producto puede ser criogénicamente congelado y preservado.
La forma de administración de los mismos suele ser a través de soluciones inyectables (evita pH ácido de estómago y pueden atravesar la pared intestinal).
Ejemplo de Método de Producción de Insulina
El primer producto génico humano manufacturado utilizando DNA recombinante y con licencia para usos terapéuticos fue la INSULINA HUMANA. N terminal
La subunidad A tiene 21 aminoácidos y la subunidad B tiene
Se utilizaron oligonucleótidos para construir genes sintéticos de las subunidades A y B (63 y 90 nucleótidos respectivamente).
La molécula de insulina madura consiste en dos cadenas polipeptídicas (cadenas A y B) unidas por puentes disulfuro.
Cada oligonucleótido sintético se insertó en un vector en una posición adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima β-galactosidasa.
El producto es un polipéptido de fusión: secuencia aminoacídica de β-galactosidasa unida a la de una de las subunidades de la insulina.
Se purifican las proteínas de fusión de extractos bacterianos y se tratan con bromuro de cianógeno: corta la proteína de fusión produciendo β-galactosidasa y una de las subunidades de la insulina.
Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontáneamente formando una molécula de insulina intacta y activa.
Modificaciones de Proteínas
El incremento en la eficacia de las proteínas se puede conseguir con la ayuda de modificaciones específicas.
Un método para inducir modificaciones en proteínas es conocido como PEGILACIÓN.
El fármaco se envuelve en una o dos moléculas de PEG (polietilenglicol) que protegen al fármaco del sistema metabólico humano, prolongando así la actividad del mismo.
Ej: modificación del interferón-alfa-2a recombinante (fabricado a partir de E.coli) como tratamiento de hepatitis B y C.
Beneficios: el fármaco permanece activo durante más tiempo en el cuerpo, se puede reducir la dosis administrada y fluctúan menos los niveles del fármaco (efectos secundarios más tolerables).
Biofármacos
Diferencias entre Biofármacos y Fármacos de Síntesis Química
CARACTERÍSTICAS FARMACOCINÉTICAS DE LOS BIOFÁRMACOS
Cuando la constante de eliminación es mayor a la de absorción.
Ventajas/Desventajas de Biofármacos
1) VENTAJAS: EFICACIA Y SEGURIDAD
Gracias a su estructura, las proteínas tienen una afinidad fuerte por una molécula diana específica.
Son poco frecuentes la aparición de interferencias o interacciones peligrosas con otros fármacos, e incluso los efectos secundarios.
2) DESVENTAJAS:
- Por su naturaleza, presentan una biodisponibilidad oral escasa.
- Es más frecuente que desencadenen reacciones inmunes.
Biofármacos en España
Hasta el día 28 de febrero de 2011 estaban comercializados en España 85 principios activos farmacológicos de origen recombinante:
- 104 medicamentos
- 313 formatos
La mayoría están calificados como medicamentos hospitalarios.
Los grupos principales de biofármacos se incluyen en los siguientes grupos:
- Anticuerpos monoclonales
- citocinas
- – enzimas
- Proteínas hormonales
- Vacunas biotecnológicas
1 Anticuerpos Monoclonales
Son: anticuerpos que derivan todos de un mismo linfocito B.
Tipos: murinos, quiméricos y humanos.
Diferencias: en la región variable.
El inicio de la obtención de anticuerpos monoclonales frente a una proteína diana se realizó mediante la fusión de linfocitos B procedentes del bazo de ratones inmunizados con la proteína de interés, y una célula de mieloma (célula neoplásica de la misma estirpe que los linfocitos B).
La nueva célula se denominó HIBRIDOMA con propiedades:
- Capacidad de producir el anticuerpo
- Inmortalidad en cultivo
El uso clínico de los primeros anticuerpos monoclonales era mayoritariamente de origen murino (ratones).
Los anticuerpos de origen murino son capaces de desencadenar respuestas de anticuerpos humanos anti-Ig murinas: pérdida de eficacia y reacción inmunitaria generalizada.
Se han desarrollado nuevos tipos de anticuerpos monoclonales: anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpos (Fab).
En un anticuerpo quimérico las regiones variables provienen de una inmunoglobulina de origen murino, mientras que las regiones constantes tienen origen humano. Ej: infliximab.
En el desarrollo de anticuerpos humanizados (human-like): regiones hipervariables del anticuerpo murino entre las regiones de entramado de un dominio variable humano, generando un dominio variable híbrido, transfiriendo una especificidad de reconocimiento determinada a una molécula completamente humana en el resto de su secuencia.
En clínica también se utilizan:
FRAGMENTOS DE ANTICUERPO (Fab): moléculas completas de anticuerpo a las que se somete a determinados procesos químicos que eliminan selectivamente determinadas fracciones proteicas, dando lugar a moléculas más ligeras, menos inmunogénicas, más solubles, etc. Ej: bevacizumab.
PROTEÍNAS DE FUSIÓN: resultado de combinar partes de anticuerpos con fracciones peptídicas de determinados receptores biológicos o de sus correspondientes ligandos. Ej. abatacept.
La mayoría de los anticuerpos monoclonales están indicados en cuadros de artritis reumatoide o en neoplasias.
2 Citocinas
Las citocinas suelen ser moléculas peptídicas ligadas a cadenas glucídicas con el fin de incrementar su estabilidad y solubilidad en el medio extracelular.
Se trata de moléculas con elevada actividad biológica pero con una duración de efectos muy breve (degradación por proteasas).
Ejercen sus funciones reguladoras mediante la unión a receptores en la superficie de las células diana y, mediante señalización celular, activan una serie de factores de transcripción para que se transcriban unos genes concretos cuyos productos son los que ejercen el efecto biológico correspondiente.
Entre las citocinas:
FACTORES ESTIMULADORES DE LA FORMACIÓN DE COLONIAS (CSF) que afectan al crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas.
EPOETINA (eritropoyetina de origen recombinante): factor estimulante de la diferenciación y maduración de los precursores de eritrocitos.
IMPORTANTE: los receptores biológicos de la eritropoyetina pueden expresarse también sobre la superficie de diversas células tumorales y existe riesgo de trombosis: se ha cuestionado su utilización en pacientes con cáncer.
INTERLEUCINA: parte esencial del sistema inmunitario (intercomunicación entre subpoblaciones de leucocitos) y también efectos indirectos sobre crecimiento y diferenciación celular hematopoyética. Hasta el momento se comercializa una forma recombinante de interleucina 2.
INTERFERONES. Los de tipo I (alfa y beta) con efectos antivirales y antiproliferativos y el tipo II (gamma) con propiedades inmunomoduladoras.
Interaccionan con receptores de membrana pero el efecto ocurre en el núcleo mediante regulación de expresión de determinados genes y la represión de otros.
FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF): hace referencia a la capacidad de esta citocina para provocar necrosis en algunos tumores pero participa también en la respuesta inmunitaria.
El único utilizado por el momento con fines terapéuticos es el TNF-alfa.
3 Enzimas
Enzimas empleadas en TERAPIAS DE RESTAURACIÓN: tratamiento de cuadros de deficiencia congénita o adquirida de determinadas enzimas implicadas en pasos metabólicos específicos.
ENZIMAS ANTITROMBÓTICAS. Enzimas recombinantes que tienen por misión estimular el sistema fibrinolítico endógeno.
En cuanto a la especificidad, los agentes antitrombóticos pueden ser clasificados principalmente en: agentes inespecíficos o fibrinolíticos (estimulan la fibrinolisis donde existe plasminógeno) y los específicos o trombolíticos (activan la fibrinolisis donde hay fibrina).
FACTORES DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA. Las formas recombinantes no presentan ventajas adicionales frente a productos obtenidos mediante extracción salvo la disponibilidad y la reducción del riesgo de contaminación biológica.
4 Proteínas Hormonales
INSULINA. Todas las insulinas comercializadas tienen un origen biotecnológico.
Modificaciones en la estructura molecular de la insulina pueden adelantar el comienzo de la acción y emular el perfil cinético de la insulina fisiológica o producir un efecto mantenido
a lo largo de más tiempo (liberación más lenta).
GONADOTROPINAS HIPOFISARIAS. Hormonas de naturaleza glucoproteica que actúan en la iniciación y regulación de la gametogénesis.
PROTEÍNA OSTEOGÉNICA 1: induce la formación de nuevo hueso fisiológicamente normal.
HORMONAS SECRETADAS POR EL LÓBULO ANTERIOR DE LA HIPÓFISIS:
La SOMATOTROPINA tiene un origen recombinante en todos los fármacos comercializados.
La HORMONA PARATIROIDEA ó PARATHORMONA (PTH) como estimuladora de la formación ósea.
5. Vacunas:
Sólo una pequeña minoría de las vacunas comercializadas en
España son recombinantes.
Para virus que el sistema inmune no es capaz de eliminar totalmente en ocasiones, cronificándose la infección y con potencial tumoral que se puede manifestar a largo plazo.
Crecen mal en cultivos de tejido.
VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB). La partícula infectiva tiene forma esférica y presenta una capa lipídica externa en la que se insertan múltiples copias de la proteína viral, que es el antígeno de superficie para proteger frente a la infección clínica del VHB.
VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. Presenta una capa externa formada por dos proteínas: L1 y L2. La L1 es la proteína más importante para inducir la respuesta inmunitaria protectora.
FÁRMACOS BIOSIMILARES
Las copias de los fármacos biotecnológicos se conocen como BIOSIMILARES.
Son producidos por un fabricante diferente del original, utilizando nuevas líneas celulares, nuevos procesos y nuevos métodos analíticos.
Pueden existir diferencias en cuanto al producto final que ocasionen ciertas características específicas a nivel de la actividad del medicamento o la aparición de determinados efectos adversos por la inmunogenicidad que pueden desarrollar.
Ej: diferencias en la glucosilación de las epoetinas (eritropoyetinas) biosimilares pueden ocasionar diferencias de hasta un 20% en la actividad con respecto al original porque la glucosilación determina la actividad biológica de la proteína.
OTRAS APLICACIONES DE BIOTECNOLOGÍA: PRUEBAS GENÉTICAS
MICROSATÉLITES-PATERNIDAD
Los marcadores microsatélites también se conocen como STRs (Short Tandem Repeats).
Se emplean comúnmente en la identificación humana debido a que son muy polimórficos (gran poder de discriminación), tasa de mutación relativamente baja, tamaño pequeño y ubicación cromosómica establecida.
Varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultánea (multiplex).
El CODIS (Combined DNA Index System), es la base de datos de DNA creada por el FBI (USA).
El CODIS utiliza un conjunto estándar de 13 regiones STRs específicos.
AMELOGENINA Discriminación del sexo
MICROSATÉLITES-PATERNIDAD Número de alelos para cada locus STR del CODIS
ACTIVIDAD MICROSATÉLITES-PATERNIDAD
Primer paso: Elaboración del árbol genealógico de una familia
Segundo paso: Recopilación datos análisis STR
Ejercicio: recopilar la información de los 3 marcadores para todos los individuos de la familia de Bob.
Ejercicio1 : Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina, ¿apoyan todos los datos sobre los genotipos de Bob, Ana, María, y David la posibilidad de que Bob y Ana son los padres biológicos de María y David?
Ejercicio 2: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Los alelos que Bob transmite a sus descendientes los heredó a su vez de Alfredo y Nuria. Identificar los alelos de los genotipos de María y David que se han heredado sin ambigüedad de cada uno de sus abuelos paternos.
Ejercicio 3: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Si no se conoce el perfil genético de Esteban pero se sabe con certeza que es el padre de Teresa, Mónica y Esther junto con su mujer Luisa, ¿qué predicciones podríamos hacer acerca de su composición para cada uno de estos marcadores?
CLONACIÓN DE ORGANISMOS
«Desde el punto de vista genético un clon no es otra cosa que un gemelo que viene al mundo con retraso» (Jens Reich).
Primeros animales en ser clonados: ranas.
Primer mamífero clonado: DOLLY en el Instituto Rosalina (Escocia).
Procedimiento:
– Extracción de células de glándula mamaria de oveja
– Cultivo celular
– Núcleos celulares se inyectan en óvulo enucleado de otra raza de oveja
– Desarrollo embrionario que da lugar a oveja clonada (Dolly: 5 de julio de 1996)
Dolly: clonación a partir de una célula de glándula mamaría por transferencia de su núcleo a un óvulo enucleado.
CONCLUSIONES:
Una célula somática puede «olvidar» todas las especificidades (diferenciación) y actuar como si fuera un óvulo fecundado «totipotente».
Procedimiento poco eficiente: la mayoría de ovejas gestantes tuvieron abortos.
Se ha descubierto que algunos animales clonados poseen telómeros más cortos que sus congéneres de la misma edad.
DIFICULTADES:
– El núcleo celular procede de una célula corporal diferenciada, en la cual ciertos genes están bloqueados. Para poder reprogramar el DNA bloqueado se deben mantener los núcleos de las células somáticas en un medio de cultivo pobre en nutrientes.
– El núcleo celular del donante está dañado de antemano por la luz UV, radicales de oxígeno reactivo (ROS) y sustancias tóxicas.
– La interacción entre óvulos enucleados y núcleos celulares no funciona sin fallos. El plasma celular del óvulo controla la función del núcleo celular correspondiente.
– El clon no es una copia exacta del donante: el DNA mitocondrial procede de la donante de óvulos. Clon genómico.