Técnicas de Esterilización y Métodos Avanzados en Microbiología

Técnicas de Esterilización en Microbiología

Esterilización por Calor

La esterilización por calor es un método fundamental en microbiología que utiliza altas temperaturas para eliminar microorganismos. El proceso se manifiesta en varias etapas:

1. Gelificación de la membrana: El transporte a través de la membrana se ralentiza hasta detenerse.
2. Reacciones enzimáticas: Las reacciones enzimáticas ocurren a velocidades crecientes y constantes.
3. Velocidad máxima: Las reacciones enzimáticas alcanzan su máxima velocidad posible.
4. Desnaturalización proteica: Se produce la desnaturalización de proteínas, el colapso de la membrana y la lisis térmica.

Existen dos tipos principales de esterilización por calor:

• Calor húmedo: Se realiza a 121°C durante 20 minutos. Este método altera la permeabilidad de la membrana y daña proteínas y ácidos nucleicos. Es adecuado para soluciones y materiales termorresistentes.
• Calor seco: Se lleva a cabo a 121°C durante 16 horas. Provoca los mismos efectos que el calor húmedo, además de la oxidación de los componentes intracelulares. Una ventaja es que no corroe materiales de vidrio y metal.

Un instrumento clave en la esterilización por calor húmedo es el autoclave. El autoclave utiliza vapor de agua a presión en una cámara presurizada. El aire se desplaza, creando una sobrepresión de 1 atmósfera. Es importante recordar que el autoclave no debe usarse con materiales no termorresistentes, botes con antibióticos o líquidos inflamables.

Esterilización por Radiación

La esterilización por radiación se clasifica en dos tipos:

• Ionizante: Rayos X, rayos gamma o haces de electrones causan ionizaciones en las moléculas, generando electrones y radicales libres. Estos dañan proteínas y ácidos nucleicos.
• No ionizante: Provoca la rotura e ionización del ADN, pero no es penetrante. Se utiliza principalmente para superficies.

Esterilización por Filtración

Este método es ideal para líquidos termolábiles, aunque es costoso y no elimina virus. Existen varios tipos de filtros:

• De profundidad
• De membrana
• De nucleación o Nucleopore

Los filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) son filtros de profundidad de alta eficacia. Eliminan hasta el 99.97% de las partículas, protegiendo tanto a los técnicos como al ambiente. Se utilizan en cabinas de flujo laminar de seguridad biológica.

Sondeo de Isótopos Estables (SIP)

El Sondeo de Isótopos Estables (SIP) es una técnica que correlaciona una actividad metabólica específica con la diversidad microbiana utilizando un isótopo estable. Por ejemplo, los microorganismos que metabolizan un isótopo estable como el ¹³C lo incorporan a su ADN. Este ADN marcado puede usarse para identificar otros microorganismos que metabolicen un compuesto orgánico enriquecido con ¹³C.

El proceso incluye:

• Estudio de filogenia a través de PCR del ARNr.
• Búsqueda de genes funcionales mediante PCR de genes implicados en el catabolismo del compuesto de interés.
• Estudios metagenómicos, como la secuenciación del ¹³C-ADN.

Virus: Características y Ciclo de Vida

Los virus son microorganismos acelulares y elementos genéticos que no pueden replicarse independientemente de una célula viva (hospedador). Son parásitos intracelulares obligados.

El ciclo de vida viral se divide en dos fases:

• Fase intracelular: Los virus utilizan la maquinaria metabólica de la célula hospedadora para multiplicarse.
• Fase extracelular: La partícula viral o virión, es la forma extracelular infectiva y metabólicamente inerte.

Tipos de Virus

• Virus Virulentos: La célula hospedadora muere tras la infección, siguiendo un ciclo lítico que implica la infección y lisis del hospedador.
• Virus Atemperados: Pueden llevar a cabo dos ciclos de vida:
  • Ciclo lítico: Infección y lisis del hospedador.
  • Ciclo lisogénico: Establecen una relación estable con el hospedador, integrando su ADN en el cromosoma de la célula (profago). El ADN viral, ahora llamado profago, se replica junto con el cromosoma. Esta relación, conocida como lisogenia, puede mantenerse durante largos periodos.

Unión e Inyección del Bacteriófago T4 en Escherichia coli

1. Adsorción: Los virus reconocen receptores específicos en la célula hospedadora y se unen a ellos.
2. Penetración: La cola del virus libera lisozima, creando un poro en la pared celular. A través de este poro, se inyecta el ADN viral en el citoplasma.
3. Replicación y maduración: Comienza la replicación, transcripción de genes virales y traducción de proteínas virales. Se ensamblan las cápsidas y se empaquetan los genomas virales.
4. Liberación: Los viriones maduros se liberan por lisis celular.

Consecuencias de la Lisogenia

1. Las células lisogénicas son inmunes a la reinfección por el mismo fago.
2. Conversión fágica: la célula lisogénica adquiere nuevas propiedades.
3. Transducción especializada: genes bacterianos adyacentes al sitio de inserción del profago se empaquetan en la cápsida con el ADN del fago. Estos genes pueden transferirse a otras bacterias, confiriéndoles nuevas propiedades beneficiosas.

Hibridación Fluorescente in Situ (FISH)

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica de biología molecular que permite detectar y localizar secuencias específicas de ADN o ARN en cromosomas o tejidos. Utiliza sondas marcadas con fluorocromos, diseñadas para unirse a secuencias complementarias en el material genético objetivo.

Pasos de la técnica FISH:

• Preparación de la muestra: Las células o cromosomas se fijan en una lámina de vidrio.
• Desnaturalización del ADN: Las hebras de ADN se separan para permitir la unión de la sonda.
• Hibridación: La sonda marcada con fluorescencia se une a su secuencia complementaria.
• Detección: La muestra se observa bajo un microscopio de fluorescencia para identificar las señales emitidas por las sondas.