Técnicas de Hibridación y Análisis del ADN

C) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN:

Objetivo:

Identificación de una determinada secuencia de bases en una cadena de un ácido nucleico procedente de una muestra utilizando una secuencia conocida marcada que permitirá su posterior cuantificación.

Técnicas de hibridación en filtro:

• Southern Blot
• Northern Blot
• Western Blot

Técnicas de hibridación in situ:

• FISH
• CISH

A. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN FILTRO:

El ácido nucleico o la sonda se encuentran inmovilizados en el filtro. El filtro puede ser de nitrocelulosa o de nylon. Todas las técnicas de hibridación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que utilizan ADN se inician con la extracción o purificación del ADN procedente del genoma y la digestión o fragmentación del ácido nucleico mediante enzimas de restricción.

SOUTHERN BLOT:

Para la detección de genes específicos en el ADN celular. Podemos visualizar fragmentos de ADN obtenidos mediante endonucleasas de restricción e hibridados con sondas marcadas.

Las etapas son:

1. Extracción o purificación del ADN procedente del genoma y la digestión o fragmentación del ácido nucleico mediante enzimas de restricción.
2. El ADN es fragmentado mediante enzimas de restricción.
3. Separación de los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa/poliacrilamida.
   • Los fragmentos de ADN migrarán hacia el polo positivo, poseen carga negativa.
   • Permite separar fragmentos de ADN que difieren en un solo nucleótido.
4. Desnaturalización de los fragmentos de la doble cadena de ADN. Separación de las dos cadenas del ácido desoxirribonucleico mediante un proceso químico al tratar el gel con una solución alcalina de hidróxido sódico. Se obtienen cadenas simples de ADN.
5. Transferencia (blotting) a un filtro.
6. Hibridación con sonda.
7. Revelado y lectura de resultados.

NOTHERN BLOT:

La molécula que se quiere identificar son cadenas de ARN. La diferencia al realizar el método radica en que no es necesario desnaturalizar ya que es un ácido nucleico monocatenario. Se utiliza frecuentemente para realizar estudios de expresión génica, para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero.

WESTERN BLOT:

Procedimiento inmunoelectroforético para la identificación de anticuerpos contra proteínas víricas específicas separadas en función de sus pesos moleculares. Se transfieren las proteínas víricas separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida a una hoja de nitrocelulosa seguido de la detección de las proteínas mediante incubación con un suero problema que puede contener anticuerpos específicos.

B. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU:

No es necesaria la destrucción de la célula para obtener la secuencia diana sino que la sonda de hibridación se une a ella en su interior; se realiza la hibridación de la sonda directamente sobre el tejido con lo que podemos visualizar directamente el segmento de ADN que intentamos localizar en el propio núcleo donde forma híbridos estables.

FISH (hibridación in situ fluorescente):

Técnica de hibridación in situ que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluorócromo que se une a secuencias diana conocidas del ADN dentro del cromosoma para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que no pueden detectarse mediante técnicas cromosómicas citogenéticas.

Etapas de la FISH:

1. Desnaturalización de la muestra de ADN.
2. Se añade sonda de hibridación marcada con un fluorócromo, que hibridará con la secuencia diana del ADN.
3. La señal emitida por la sonda se observa mediante luz ultravioleta o un microscopio de fluorescencia.
   • Si la FISH se realiza sobre células en metafase permite detectar microdelecciones, material genético extra o reorganizaciones del material genético.
   • Sobre células en interfase permite detectar el número de uno o varios cromosomas o reorganizaciones del material genético.

MICROARRAYS O BIOCHIPS:

Gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido de manera que forman una matriz bidimensional de material genético que permite la automatización simultánea de miles de ensayos con el objetivo de conocer la estructura y funcionamiento de una dotación genética.

Ventaja:

Posibilidad de analizar simultáneamente miles de genes. Actualmente se aplica a análisis de expresión génica, detección de mutaciones…

PCR (reacción en cadena de la polimerasa):

Técnica de biología con objetivo de obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN partiendo de una mínima cantidad. Nos permite detectar in vitro una secuencia determinada de nucleótidos mediante un proceso que imita la replicación del ADN in vivo pero amplificando el proceso hasta obtener más de 10⁶ veces la secuencia original. La técnica de la PCR está automatizada mediante un aparato llamado termociclador de PCR que está dotado de un programador de tiempos y temperaturas y que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción regulando la entrada y salida de agua a las temperaturas necesarias en las distintas etapas.

TÉCNICA DE LA PCR:

Debemos obtener una solución que contenga ADN bicatenario que incluya la secuencia de bases (secuencia diana) que queremos determinar. Tras la extracción y purificación, el extracto obtenido se mezcla con los reactivos en un recipiente adecuado y se sitúa en el termociclador de PCR donde se somete a unos ciclos de temperatura que se repiten entre 25 y 45 veces hasta obtener la amplificación del ADN requerida. En cada ciclo se suceden tres fases: desnaturalización, hibridación y extensión.

1. Repetición de los ciclos de extensión hasta que se alcance la dimensión deseada (30-40 veces).
2. Elongación final.
3. Detección del ADN amplificado.

Características PCR:

• Especificidad elevada.
• Sensibilidad alta.
• Fidelidad.

Inconvenientes PCR:

Contaminación y aparición de material genético extraño o de arrastre de ADN anteriormente amplificado que conlleva la aparición de falsos positivos que para evitar utilizamos guantes, material desechable etc.

Aplicaciones PCR:

• Enfermedades neoplásicas.
• Medicina legal y forense.
• Detectar ADN viral en genoma celular.
• Cuantificación de la carga viral mediante la PCR en tiempo real (VIH).
• Posibilidad de utilizar ADN humano en animales transgénicos para producir órganos aptos para el transplante.
• Enfermedades infecciosas.

Variantes PCR:

• Nested PCR.
• Multiplex PCR.
• PCR degenerada.
• PCR inversa.

TECNOLOGÍA DEL ADN:

ÁCIDOS NUCLEICOS:

Polímeros constituidos por la unión mediante enlaces químicos de unidades menores llamadas nucleótidos. Los ácidos nucleicos son compuestos de elevado peso molecular -> macromoléculas.

Componentes de los nucleótidos:

Los nucleótidos están formados por: una base nitrogenada (BN), un azúcar (A) y ácido fosfórico (P); unidos en el siguiente orden: PABN.

Nucleósidos:

El azúcar y la base nitrogenada se unen entre sí.

FUNCIONES GENERALES:

Participan en los mecanismos mediante los cuales la información genética se almacena, replica y transcribe, sirven de intermediarios en las transferencias de energía en las células o en las transferencias de electrones.

ADN (DNA):

Concepto:

Polinucleótidos constituidos por d-AMP, d-GMP, d-CMP y d-TMP. Los nucleótidos del ADN no tienen ni uracilo, ni ribosa, su azúcar es la desoxirribosa.

Características:

Los ADN celulares tienen una elevada masa molecular.

Técnicas de análisis:

Las determinaciones que se realizan son:

Niveles de á-fetoproteína sérica materna:

Que permiten seleccionar a aquellas mujeres con un riesgo suficientemente alto como para realizar una amniocentesis.

Cariotipo:

Que permite identificar alteraciones en el número o estructura de los cromosomas.

Deficiencias enzimáticas.

AMNIOCENTESIS:

Se realiza entre las semanas 15-17 de la gestación y consiste en la obtención de 20 a 30 mL de líquido amniótico mediante una punción abdominal donde antes se realiza una ecografía a tiempo real que permite valorar la posición de la placenta, la localización del líquido amniótico y el feto. El líquido obtenido contiene células de origen fetal que provienen de piel, riñones, tracto respiratorio y gastrointestinal, pared de amnios.

Biopsia de las vellosidades coriónicas:

Se utiliza en el diagnóstico prenatal durante el primer trimestre. Las vellosidades se aspiran mediante una jeringa posteriormente se cultivan y se obtiene: el cariotipo, la mayoría de las enzimas y se extrae ADN para estudios moleculares genéticos.

CARIOTIPO:

Clasificación ordenada de los cromosomas de acuerdo a sus características (forma, tamaño, localización del centrómero y disposición longitudinal de las bandas).

Pasos:

1. Cultivo de la muestra: las células de la muestra se depositan en un medio adecuado para su cultivo al que se añade fitohemaglutinina (agente mitógeno) y se incuba a 37º C durante 48-72 horas.
2. Obtención de cromosomas en metafase: Se añade colchicina al medio de cultivo con lo cual se detiene la mitosis en metafase (cuando mejor se aprecian los cromosomas); se rompen las membranas celulares y los cromosomas se fijan mediante una mezcla de ácido acético y metanol.
3. Realización de las preparaciones: extensión, se tiñe (Giemsa) y se observa al microscopio. Se deben analizar 25 metafases elegidas al azar.
4. Cariotipo: se fotografían las metafases elegidas y se amplían hasta obtener imágenes nítidas de los cromosomas que se recortan y se ordenan sobre un papel en orden de tamaño decreciente y se numeran de 1 al 22 teniendo en cuenta la situación del centrómero y la longitud de los brazos. Los cromosomas sexuales se sitúan como grupo aparte.

Cariotipo automatizado:

Se realiza mediante un microscopio acoplado a una cámara de video y un ordenador el cual hace la búsqueda de metafases, individualiza y ordena los cromosomas e imprime el cariotipo de las células de la muestra.

Bandeo cromosómico:

Tinciones que tiñen selectivamente zonas del cromosoma originando la formación de bandas cuyo número y posición son características de cada cromosoma.

Técnicas citogenéticas moleculares (biología molecular):

Podemos identificar bases moleculares de algunas enfermedades genéticas, la mayoría de ellas con un pronóstico incierto.

Ventajas:

• Necesitan cantidades pequeñas de muestra.
• Detectan cantidades de ácidos nucleicos muy pequeñas.
• Alta especificidad.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

Se basa en la capacidad que tienen dos cadenas de ácidos nucleicos de reconocerse y unirse específicamente entre ellas si existe un número suficiente de pares de bases complementarias. Según el grado de homología las dos cadenas de ácidos nucleicos estarán más o menos unidas y si estas dos cadenas carecen de complementariedad, permanecerán separadas. La hibridación de una cadena de un ácido nucleico consiste en la unión de una cadena de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico marcada –sonda de hibridación-, a su correspondiente cadena de ácido nucleico complementaria procedente de una muestra biológica –secuencia diana-. La unión que mantiene la hibridación son puentes de hidrógeno que se establecen entre bases de las dos cadenas pudiendo afectar a estas uniones la temperatura o el pH.

Para el desarrollo de las técnicas de hibridación son necesarios:

El ácido nucleico procedente de la muestra biológica, la sonda de hibridación y endonucleasas de restricción.

A) SONDAS DE HIBRIDACIÓN:

Fragmentos de ácidos nucleicos monocatenarios marcados. Constituidos por nucleótidos siendo sintetizados en el laboratorio de tal forma que su secuencia de bases es complementaria a la de la cadena del ácido nucleico diana.

Podemos utilizar sondas de varios tipos:

Sondas centroméricas:

Formadas por una secuencia de ADN que hibrida con el ADN de la región centromérica del cromosoma. Permiten detectar alteraciones cromosómicas numéricas en núcleos en metafase e interfase.

Sondas de pintado cromosómico:

Formadas por una batería de sondas que hibridan con todo el cromosoma. Permite identificar anomalías numéricas y estructurales en núcleos en metafase. Es útil cuando los cromosomas son de mala calidad y la citogenética convencional no es suficiente.

Sondas de secuencia única o locus específicos:

Hibridan con una zona de ADN concreta en núcleos en metafase o interfase. El sistema de marcaje de la sonda de hibridación condiciona el modo de detección y lectura de resultados.

Entre los métodos de marcaje más comunes encontramos:

1. Marcaje de la sonda con una sustancia química.
2. Marcaje con un isótopo radiactivo.
3. Marcaje mediante una sustancia fluorescente.

B) ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:

Enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo el enlace fosfodiéster que se establece entre el carbono 3´ de una pentosa y el 5´ de la siguiente. Las exonucleasas hidrolizan los enlaces desde los extremos de la cadena mientras que las endonucleasas lo hacen por el interior. Son capaces de reconocer una secuencia determinada de pares de bases y fragmentar la molécula de ADN en puntos específicos de la cadena, siempre por el mismo lugar, dando origen a un conjunto de fragmentos de ADN.