CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es una técnica analítica que tiene como finalidad la separación de distintos componentes de una mezcla de solutos que se distribuyen entre dos fases debido a la diferente afinidad que presentan por cada una de ellas.
Los distintos componentes de la muestra se van a separar en función de su distribución entre un fluido (fase móvil o eluyente), que actúa como portador de la mezcla, y una fase estacionaria (de gran superficie), de tal manera que un compuesto que tenga más afinidad que otro por la fase estacionaria avanzará más lentamente a través de la misma arrastrada por la fase móvil. De la misma forma, los componentes de la mezcla con menor afinidad por la fase estacionaria se desplazarán con mayor rapidez.
La cromatografía presenta dos fases:
- Fase móvil: compuesta por un líquido o un gas en el cual están disueltos los solutos que se van a separar.
- Fase estacionaria: que corresponde a la superficie a través de la cual va a pasar la fase móvil. La fase estacionaria está situada sobre un soporte sólido o en una columna y puede ser un sólido o un líquido inmiscible con la fase móvil que va a fluir a través de la propia fase estacionaria.
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Podemos realizar la clasificación de las técnicas cromatográficas de acuerdo a:
a) La naturaleza de la fase móvil -líquida o gaseosa- y de la fase estacionaria -sólida o líquida-.
b) Los mecanismos físicos de separación de los solutos entre las dos fases: adsorción, partición, intercambio iónico, exclusión molecular, afinidad.
c) Según el instrumental empleado: soportes planos y en columna.
A) CLASIFICACIÓN EN FUNCIÓN DEL EMPLEO DE DISTINTAS FORMAS DE SOPORTE
1. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
El soporte es plano y consiste en una hoja de papel de filtro con formas diferentes constituida por fibras de celulosa de gran pureza entre las cuales se encuentra la fase estacionaria que es un líquido absorbido entre las fibras del papel.
La fase móvil, líquida, está formada por solventes que se eligen en función de los componentes de la muestra que se pretenden separar. Esta fase móvil se extiende por capilaridad a través del soporte desplazando, a su vez, el líquido en el que está impregnada. Simultáneamente arrastra los componentes de la muestra, hacia posiciones o zonas superiores debido a la existencia del fenómeno de partición – las sustancias a separar presentan distinta solubilidad respecto a la fase móvil y la estacionaria que, a su vez, son inmiscibles entre sí.
La técnica consiste, básicamente, en:
1. Aplicación de la muestra sobre el papel y dejar secar. La muestra penetra hacia el interior de la fase estacionaria.
2. Introducción del soporte (papel) en la cámara de desarrollo y en posición vertical.
3. Separación en función del reparto de los componentes entre las dos fases; los que más afinidad tengan por la fase estacionaria, se localizarán más cerca del punto de aplicación y viceversa. Esta afinidad relativa se conoce como factor de retención (Rf) y representa la relación existente entre la distancia recorrida por la sustancia y la recorrida por el líquido de desarrollo.
Rf=Xn/x.
El valor del factor de retención (Rf) está condicionado por:
a) La composición del líquido de desarrollo, que a su vez dependerá de la sustancia a separar
b) La temperatura de realización de la técnica.
c) Las características del soporte utilizado.
La separación termina cuando el solvente ha alcanzado el frente del papel o ha transcurrido el tiempo determinado para la misma. En este momento se procede a sacar el papel de la cámara de desarrollo, señalar el nivel alcanzado por la fase móvil – frente del disolvente- y dejar secar.
4. Detección de los distintos componentes de la mezcla.
Para una determinación cualitativa de los componentes de la muestra se calcula para cada una de las sustancias separadas su factor de retención (Rf) y se busca en unas tablas donde se encuentran los Rf de diversas sustancias y así sabremos la sustancia que se ha separado. Hay que estandarizar la técnica para poder comparar los Rf, por lo tanto deberemos poner unas mismas condiciones de temperatura, pH, disolvente… ya indicadas en las tablas de referencia.
Si pretendemos una determinación cuantitativa, la podemos llevar a cabo por fotometría o bien sometiendo una muestra patrón al mismo desarrollo cromatográfico que la muestra problema y comparar los resultados obtenidos.
2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
El soporte es plano, constituido por una superficie de vidrio (placa de vidrio) o folios de plástico (poliéster) o metal (aluminio) recubierto por una pasta acuosa de un material adsorbente inerte, compuesto por partículas de celulosa, gel de sílice, poliamida, gel de óxido de aluminio o gel de silicato magnésico.
La fase estacionaria -> sólida, fase móvil -> líquida.
La separación de la muestra se produce en función de la adsorción de los componentes de la muestra por la fase estacionaria, es decir, una sustancia es atraída y posteriormente retenida por la superficie de ciertas sustancias debido a interacciones (de tipo electrostático, puentes de hidrogeno o fuerzas de Van der Waals) que se producen entre el soluto y las moléculas de la fase móvil con la fase sólida. Por tanto, las sustancias se acumulan en la superficie de la interfase sólido-líquido con una concentración mayor que en el interior de la fase.
3. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
La columna es el lugar donde ocurre la separación de los componentes de la mezcla. Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio ó teflón; contiene en su interior una sustancia sólida que puede actuar como fase estacionaria propiamente dicha o bien como soporte a un líquido que constituye la fase estacionaria.
La función básica del soporte es la de «mantener» (sostener, retener) la fase estacionaria. Idealmente debería ser un material inerte que «mantiene» la fase estacionaria sobre su superficie como una película delgada. La mayoría de los soportes cromatográficos están hechos de diatomita que químicamente es casi todo sílice con algunas impurezas y domina el campo de los soportes debido a su estructura, superficie y disponibilidad. La fase estacionaria es de naturaleza variable –sólida o líquida– y es una sustancia adsorbente (silicagel, alumina); la fase móvil –líquido o gas– es un disolvente de la muestra que no reacciona con ella. Por tanto la cromatografía en columna puede ser líquida o gaseosa.
Los mecanismos de separación utilizados el la cromatografía en columna es adsorción si la fase estacionaria es sólida y partición si es líquida.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Consigue separaciones en tiempos muy cortos -minutos- utilizando muestras de pequeño volumen.
Consta de una columna de vidrio o acero inoxidable en cuyas paredes se encuentra la fase estacionaria formada por partículas de pequeño tamaño y una bomba de presión muy alta que permite mantener un flujo adecuado de la fase móvil. El detector de las sustancias eluidas está basado en la espectrofotometría de absorción, espectroscopia de fluorescencia (alta sensibilidad y especificidad), espectrometría de masas (alta sensibilidad y especificidad pero carísimo), obteniendo un registro de picos.
Instrumentación básica: depósitos que contienen la fase móvil (disolvente), bomba de alta presión, inyector de la muestra, columna, detector, procesador de datos (cromatograma).
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Utilizada para analizar muestras que puedan ser volatilizadas.
La fase móvil es un gas que proviene de un tanque a presión y la fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido siendo el mecanismo físico de separación la adsorción y la partición respectivamente. La cromatografía gas-sólido tiene escasa utilidad.
La cromatografía gas-líquido se realiza en columnas que consiste en un tubo capilar enrollado helicoidalmente de un tamaño variable donde se produce la interacción entre la muestra y la fase estacionaria.
Columnas: 2 tipos:
- Empaquetadas: cortas (1-6m), diámetro interno grande (2-4mm).
- Capilares: largas (30-60m), diámetro interno pequeño (0,1-0,5 mm).
Instrumentación básica: depósitos de gas (fase móvil), regulador de presión y caudal (manómetro, tapón de silicona), inyector de muestra -> septum: evita que la muestra evaporada salga -> volatilización: si es líquida, columna -> horno termostático, detector, ordenador.
B. CLASIFICACIÓN SEGÚN LOS MECANISMOS DE SEPARACIÓN
1. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC)
Fundamento: Las diferencias existentes entre el signo y la magnitud de las cargas eléctricas de los iones de la muestra a separar; estos iones pueden intercambiarse con otros situados en la fase móvil y en la estacionaria.
Es una cromatografía líquida (L/S); la fase estacionaria, sólida, consiste en resinas de intercambio iónico que poseen grupos cargados, positivos o negativos. Si la carga de la resina es positiva, se les denomina resinas de intercambio aniónico, separan aniones, eluyen + rápido, y si la carga de la resina es negativa se les denomina resina de intercambio catiónico y separan cationes, tardaran + en eluir.
2. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR O FILTRACIÓN DE GELES
La separación de las moléculas se fundamenta en la diferencia de tamaño y forma molecular de las sustancias a separar.
Es una cromatografía líquida (L/S) que se realiza en columnas y el mecanismo de separación es por exclusión molecular. La fase móvil es líquida – agua o solución electrolítica- y la fase estacionaria, sólida, consiste en un gel muy hidrófilo que presenta poros de un determinado tamaño. Las sustancias a separar se introducen en la columna y aquellas cuyo tamaño es mayor que el del poro del gel pasan sin quedar retenidas. Las moléculas de menor tamaño penetran en los poros quedando retenidas por el gel, siendo más tarde eluídas.
3. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La separación basada en interacciones de tipo iónico, puentes de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals, que se establecen entre las sustancias a separar de la muestra y las moléculas de la fase móvil con la fase estacionaria -adsorbente-.
Para finalizar la cromatografía, se cambia la polaridad de la fase móvil con lo que se produce la elución de las sustancias más retenidas.
4. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Basada en la separación de distintos solutos por su diferente solubilidad entre una fase móvil y una estacionaria inmiscibles entre sí.
5. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Técnicas que están basadas en mecanismos que implican afinidad entre dos elementos. La fase estacionaria tiene unido el «ligando». Cuando pasa a través de ella la fase móvil con las sustancias a separar, aquellas que presenten interacciones específicas -afinidad- por el ligando quedaran retenidos en la fase estacionaria situada en la columna, siendo después eluidos con otros metabolitos que presenten mayor afinidad por el ligando o cambiando las condiciones físico-químicas de la fase móvil.
Factor de retención (Rf)
Relación entre la distancia desde el punto de aplicación al centro de la mancha (xn) y la distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente (x). Se utiliza para identificar sustancias por comparación con el Rf de sustancias conocidas y determinadas en condiciones de trabajo idénticas.
Rf=Xn/x.
Coeficiente de distribución (Kd)
Relación entre la concentración molar de soluto en la fase estacionaria (FE) y la concentración molar de soluto en la fase móvil (FM), mostrando numéricamente la afinidad del soluto por las distintas fases, cuanto mayor es Kd mayor es la proporción de soluto retenida por la fase estacionaria.
Kd = CFE / CFM.
Volumen de retención o volumen de elución
Para realizar una cuantificación por cromatografía es necesario eluir; el volumen de elución es el volumen de eluyente que se necesita aplicar para que aparezca una sustancia en el cromatograma. Cuanto mayor sea el coeficiente de distribución de un soluto mayor será su volumen de retención.
Tiempo de retención (tr)
Tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y el máximo del pico cromatográfico al que sale eluida en el cromatograma.
Tiempo de referencia ™ – tiempo muerto
Aquel al que sale eluida una sustancia no retenida por la fase estacionaria. Refleja las características físico-químicas de retención de un determinado componente de la muestra.
Tiempo ajustado (t´r)
Corresponde al tiempo de retención descontando el tiempo muerto.
t´r = tr – tm.
Resolución o capacidad de separación
En un cromatograma, tras la elución y lectura de las fracciones, aparecen representadas en picos cada una de las sustancias separadas. El objetivo es que las sustancias queden separadas lo mejor posible, a esta capacidad de la técnica cromatográfica es lo que denominamos resolución.
OTRAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
FILTRACIÓN
Separación de las partículas de un sólido del líquido en el que se encuentra disperso, mediante la utilización de un cuerpo permeable y poroso (filtro) a través de cuyos poros, de tamaño variable, pasa el líquido filtrado quedando el residuo sólido retenido.
TIPOS DE FILTROS
Se emplean junto a un embudo cónico, dónde va alojado el filtro plegado de forma especial para aumentar la superficie de contacto.
Papel de filtro
Se debe realizar una elección adecuada del tamaño del poro en función del tamaño de las partículas del sólido a separar.
Membranas filtrantes
Compuestas por polvo de vidrio aglomerado montado sobre un embudo o crisol. Presentan resistencia a la agresión química. Permite múltiples filtraciones.
MÉTODOS DE FILTRACIÓN
Filtración por gravedad
Se pueden utilizar un filtro liso, si queremos recoger sólido tras la filtración, o filtro de pliegues. Los filtros pueden confeccionarse o comprarlos ya realizados. La colocación en el embudo debe ser lo más ajustada posible.
Técnica de recogida
- Dejar reposar el líquido para que sedimenten las partículas sólidas.
- El filtro no debe nunca llenarse hasta el borde.
- Verter el líquido a un ritmo adecuado.
- Evitar salpicaduras (la varilla del embudo debe tocar la pared del recipiente colector y estar por encima del nivel del filtrado).
Filtración por succión
Se utiliza un matraz especial llamado Kitasato. La filtración se produce por acción de una diferencia de presión debida a la aplicación de vacío al recipiente donde se recibe el filtrado.
Se necesita
Un embudo Buchner, un filtro redondo, un matraz Kitasato, un adaptador de goma para asegurar el cierre entre el embudo y el tubo, una fuente de vacío.
DIÁLISIS
Permite que las moléculas grandes y las pequeñas de una disolución puedan separarse por difusión selectiva a través de una membrana semipermeable (dializadora) que presenta un tamaño de poro que permite el paso de las sustancias pequeñas pero no el de las moléculas grandes.
UTILIDAD
Enriquecimiento proteico en fluidos biológicos.
DECANTACIÓN
Proceso físico de separación para separar mezclas heterogéneas. Puede ser L-L o S-L. Se basa en la diferencia de densidad.
TÉCNICA
- Dejar reposar la mezcla para que el sólido sedimente.
- Extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur o inclinar cuidadosamente el recipiente vertiendo el sobrenadante.
EXTRACCIÓN
Separación de uno o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente.
CONDICIONES DEL DISOLVENTE
Ser capaz de disolver completamente la sustancia a separar (poder separador) sin disolver el resto.
UTILIDAD
Eliminar impurezas de una muestra. Obtener el enriquecimiento de compuestos químicos.
CLASIFICACIÓN
Extracción sólido-líquido
Separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido.
Fases
- Poner en contacto el sólido con el disolvente.
- Separación del disolvente más soluto disuelto del resto del sólido.
- Recuperación del soluto disuelto mediante técnicas como destilación o evaporación.
Variante de la extracción: que se utiliza para evitar el consumo de grandes cantidades de disolvente: extracción continua, que mediante unos dispositivos permite llevar a cabo buenas extracciones, con pequeñas cantidades de disolvente. El sistema más utilizado es el Soxhlet.
Extracción líquido-líquido
La sustancia a extraer se encuentra en una disolución líquida y se extrae mediante un disolvente líquido, inmiscible o poco soluble en la disolución.
La forma más sencilla de efectuar una extracción en un laboratorio, es mediante una ampolla o embudo de decantación. Se agitan vigorosamente unos minutos la mezcla anterior, con la finalidad de poner en contacto la disolución y el líquido extractor. Después con la llave del embudo separaremos las dos fases.
DESTILACIÓN
Separación -por acción del calor- de un líquido volátil de una sustancia no volátil o de otro líquido cuyo punto de ebullición sea diferente, recogiendo los vapores tras su condensación.
FASES
- El líquido alcanza el punto de ebullición y pasa al estado de vapor.
- El líquido se condensa y es recogido en un recipiente apropiado.
TIPOS
Simple
Permite separar un líquido de un sólido o dos líquidos cuyo punto de ebullición difiera en más de 80ºC.
Fraccionada
Para separar mezclas de dos líquidos cuyo punto de ebullición es muy próximo. Se repite varias veces el proceso obteniendo en cada una de ellas una mayor cantidad del líquido cuyo punto de ebullición es mayor.