Espectrometría de Absorción Molecular
La Espectrometría de Absorción Molecular se caracteriza por su alta especificidad (↓) y sensibilidad. Esta técnica se utiliza principalmente para análisis cuantitativo, no cualitativo, ya que las moléculas no absorben una longitud de onda (λ) determinada, sino intervalos. La determinación de la concentración de un compuesto se puede realizar de forma:
- Directa: Midiendo la absorbancia del compuesto.
- Indirecta: Cuando el compuesto no tiene absorbancia, se marca con un reactivo. Se basa en reacciones previas (U+X=Y, A+Y=B) donde B tiene menor absorbancia, y reacciones subsecuentes (A+B=D, D+P=Q) donde Q tiene mayor absorbancia.
Existen dos tipos principales de espectrometría de absorción molecular:
UV-Visible
Utiliza el rango del espectro UV-Visible. Presenta una gran aplicabilidad, buena sensibilidad, automatización, no altera ni destruye la muestra. Sin embargo, presenta interferencias por los intervalos amplios de absorción. En el ámbito clínico, se utiliza para determinar ácido úrico, glucosa y lactato.
IR
Utiliza el rango del espectro IR, donde la mayoría de las moléculas absorben. Presenta picos de absorción muy específicos, concretos y estrechos, lo que permite especificar e identificar moléculas e incluso células. El instrumento utilizado se denomina espectrómetro de Fourier.
Espectrometría de Absorción y Emisión Atómica
Las interferencias comunes en esta técnica son: química, por ionización y de matriz. Los procesos principales son la absorción y la emisión.
Absorción Atómica
Técnica exacta y precisa, con alta especificidad y sensibilidad. Las bandas de absorción son pequeñas. Se utiliza para análisis cuantitativo y cualitativo de elementos metálicos. Se puede realizar en llama o con atomizadores.
En Llama
- Consumo total: La mezcla en la llama no se junta con el combustible, lo que aumenta el tiempo de análisis (ta), disminuye la interferencia, pero favorece la interferencia química.
- Premezclado: La mezcla y el combustible se juntan, lo que disminuye el tiempo de análisis, pero aumenta la interferencia.
Con Atomizadores
Aumenta la atomización, la sensibilidad y el tiempo de análisis. Disminuye las interferencias. Sin embargo, el aparato es más complejo y caro. Se utilizan lámparas de cátodo hueco, donde el cátodo está hecho del elemento a medir.
Emisión Atómica
Los elementos más utilizados son Mg, Ca, Li, Na y K. Se realiza en llama, donde se mide la intensidad de la emisión. La intensidad de la luz emitida es proporcional a la concentración del compuesto. Se utilizan estándares internos para minimizar las variaciones y medir la intensidad del elemento conocido (concentración constante) y su alteración se aplica a la muestra.
Espectrometría de Emisión Molecular
También llamada fluorescencia, se basa en la emisión de luz por una molécula excitada. La energía de la luz emitida es menor que la energía de la luz absorbida (eg > λ). El tiempo de emisión es muy corto (10-8 s). No todas las moléculas presentan fluorescencia, por lo que se pueden añadir fluorocromos. Se utiliza para cuantificar e identificar moléculas. Presenta una alta sensibilidad. El aparato utilizado se denomina fluorímetro (fuente de luz: rayos X-UV). Se debe utilizar siempre un patrón. Las interferencias se producen si hay moléculas que absorben la energía de excitación de otras. El detector se coloca a 90º. A mayor fluorescencia, mayor concentración.
Espectrometría de Dispersión de Radiación
Los factores que influyen en la dispersión de la luz son: tamaño y peso molecular (a menor tamaño, mayor dispersión), concentración de partículas (a mayor concentración, mayor dispersión), longitud de onda de la radiación incidente (a mayor λ, mayor dispersión) e índice de refracción (medios con diferente densidad).
Turbidimetría
Se mide la luz transmitida a 180º. A mayor concentración, mayor turbidez. Se utiliza para partículas de gran tamaño.
Nefelometría
Se mide directamente la dispersión a 90º. Se utiliza para partículas de menor tamaño.
Refractometría
Método óptico basado en las propiedades de la luz, específicamente en la refracción. Se basa en la ley de Snell. En el ámbito clínico, se utiliza para medir la densidad de la orina y las proteínas totales en suero. La refracción es la desviación que sufre la luz al atravesar dos medios con diferente densidad. El refractómetro mide el índice de refracción y consta de:
- Prisma de iluminación: Rugoso, produce la dispersión de la luz.
- Prisma de refracción: Pulido, produce la refracción de la luz.
Fotometría de Reflectancia
Se basa en la medición de la cantidad de luz reflejada por el elemento a analizar. A mayor cantidad de luz reflejada, mayor cantidad de compuesto. Los refractómetros o reflotrones utilizan reactivos que producen una reacción colorimétrica. A mayor intensidad de color, mayor concentración.
Espectrometría de Masas
No es una técnica espectroscópica (no mide la interacción radiación-materia). Mide la relación masa-carga. Su característica fundamental es la fragmentación específica de cada molécula, generando iones que sirven para la identificación y cuantificación. Se puede acoplar a la cromatografía de gases o líquidos. Presenta una alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, es una técnica cara, con un tiempo de análisis elevado y pocos laboratorios la tienen disponible.
Técnicas de Separación
Una mezcla está formada por dos o más componentes unidos físicamente, no químicamente. Las técnicas de separación tienen dos fases:
- Fase dispersante o disolvente: No cambia el estado de agregación (mayor cantidad).
- Fase dispersa o soluto: Cambia el estado de agregación (menor cantidad).
Centrifugación
Se utiliza para separar sólidos en suspensión en líquidos. La magnitud de la fuerza centrífuga depende de: velocidad de giro, masa del sólido y radio de giro (a mayores magnitudes, mayor centrifugación). Tipos de centrifugación:
Diferencial
Se basa en la velocidad de sedimentación. Se obtienen dos fases: pellet (sólido) y sobrenadante (líquido). La separación se produce en función de la velocidad de sedimentación. Se utiliza para la obtención de plasma y el fraccionamiento subcelular.
En Gradiente
Se utilizan medios con distintas densidades. La separación es más específica. Se pueden separar elementos sólidos y líquidos.
Ultracentrifugación
Se utilizan velocidades muy elevadas (50.000 rpm). Se utiliza para separar solutos con coeficientes de sedimentación bajos. La cámara del rotor está refrigerada, acorazada y al vacío.
Electroforesis
Separa partículas según su movilidad en un medio bajo la influencia de un campo eléctrico. Las partículas con carga positiva se dirigen hacia el electrodo negativo o cátodo (cationes), y las partículas con carga negativa se dirigen hacia el electrodo positivo o ánodo (aniones). Tipos de electroforesis:
Libre
Los solutos difunden libremente.
En Zona
Los solutos difunden libremente en un medio líquido. Se dirigen hacia el polo opuesto, pero no se forma un frente específico de migración (movimiento Browniano). Para solucionar esto, se utiliza un soporte para que la migración sea homogénea.
Pasos de la electroforesis:
- Preparación de la muestra.
- Selección y preparación del soporte. Puede ser:
- Restrictivo: Ofrece resistencia a la migración en función del tamaño o peso molecular.
- No restrictivo: No ofrece resistencia a la migración. Las características del soporte deben ser: inerte químicamente, consistente y homogéneo, estable (pH) y barato.
- Características del campo eléctrico: A mayor intensidad/voltaje, mayor migración.
- Carga neta de la partícula: A mayor carga, mayor fuerza de migración.
- Coeficiente de fricción: Depende del soporte. A mayor resistencia, mayor coeficiente de fricción, mayor viscosidad, mayor fuerza de fricción.
- Fuerza iónica del tampón: A mayor fuerza iónica, mayor cantidad de iones, mayor intensidad/voltaje, menor migración (la migración se produce por el tampón, no por el soporte).
- Propiedades del soporte.
- Temperatura: Un ligero aumento de la temperatura aumenta la migración. Un aumento excesivo de la temperatura disminuye la migración.
Tipos de electroforesis según el soporte:
- En papel: No se utiliza debido a la electroendosmosis.
- En acetato de celulosa: Es la más utilizada. El soporte es una membrana de acetato de celulosa. El ánodo y el cátodo están en cubetas con buffer. Presenta una rápida migración y una buena resolución. Se utiliza para el proteinograma.
- En gel de agarosa: El agar es líquido a 50ºC y sólido (gel) a temperaturas superiores. El soporte es agarosa. Se utiliza para la electroforesis de ADN (PCR).
- En gel de poliacrilamida: El soporte es acrilamida en forma de gel. Es un soporte restrictivo. Permite la separación en función del tamaño molecular (las moléculas más grandes quedan arriba del gel y las más pequeñas abajo). El gel es estable a altas temperaturas e inerte. Presenta una buena resolución.
- Isoelectroenfoque: Separa las moléculas en función de su punto isoeléctrico (pI) utilizando un gradiente de pH. Cuando las moléculas alcanzan su pI, su carga neta es cero y dejan de migrar. Se utiliza para la separación de proteínas y aminoácidos (ya que son anfóteros, pueden tener carga positiva o negativa dependiendo del pH).
- Bidimensional: Combina dos dimensiones de separación. Primero se realiza un isoelectroenfoque para separar las moléculas por su pI, y luego se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida para separarlas por su tamaño molecular.
- Capilar: Es una electroforesis tradicional pero a pequeña escala, utilizando capilares de 10-100 µm de diámetro. Presenta las ventajas de la automatización, la posibilidad de utilizar altos voltajes y un tiempo de análisis muy corto (segundos).